水貂肠炎细小病毒在体内分布规律及相关细胞因子的变化

• 作 者: 王洋
• 机 构: 中国农业科学院
• 出 处: 中国农业科学院
• 发表日期: 2016年期
• 关键词: 水貂肠炎病毒 细胞因子 白细胞介素 致病机理

水貂病毒性肠炎(Mink parvoviral enteritis),是由水貂肠炎细小病毒(Mink enteritis virus MEV)引起的高度接触性传染病,发病水貂的主要临床特征为剧烈腹泻和呕吐等,该病具有较高的发病率和死亡率。随着毛皮动物养殖业的迅速发展,此病也时常爆发,给水貂养殖业造成巨大的经济损失。因此研究水貂肠炎病毒的致病性和免疫相关因子变化对MEV的预防具有重要作用。为检测水貂IFN-α、IFN-β和IFN-γmRNA,建立了荧光定量RT-PCR检测方法,根据GenBank设计引物,通过RT-PCR扩增IFN-α、IFN-β、IFN-γ和GAPDH基因片段,连接到pMD18-T载体中制备质粒标准品,建立了相应基因mRNA的荧光定量RT-PCR检测方法并建立标准曲线。结果表明:GAPDH、IFN-α和IFN-β和IFN-γ基因的Ct值与标准品稀释度在1×101copies/μL~1×107copies/μL内均呈良好的线性关系,相关系数(R2)均为1.00,熔解曲线均呈单一熔解峰,检测下限为10copies/μL,重复性试验结果表明组内、组间变异系数均小于4.5%。临床样品检测结果表明水貂感染肠炎病毒后,IFN-α、IFN-β和IFNγ相对表达水平均在6d达到最高峰值,IFN-α相对表达量要比IFN-β和IFN-γ相对表达量高,并且在感染期(4d~6d)IFN-α相对表达量明显上调。本研究为水貂IFN mRNA的定量分析提供了有效工具。为研究水貂肠炎病毒强毒株SMPV-11和弱毒疫苗株MEVB-F61分别感染水貂后,水貂细胞因子的动态变化,现采用已建立并应用的SYBR GreenⅠ染料法荧光定量RT-PCR检测方法,检测不同MEV(SMPV-11和MEVB-F61)感染水貂后,水貂细胞因子的动态变化。检测结果表明:在感染SMPV-11和MEVB-F61病毒后,IFN-α、IFN-β、INF-γ和IL-4相对表达量在2d~6d逐渐升高,并且在第6d达到峰值;并且IFN-α、IFN-β、INF-γ和IL-4在10d和15d SMPV-11组的表达量均高于MEVB-F61组;TNF-α的相对表达量与前三者有所差异,在0d~2d mRNA表达量逐渐升高,第2d达到最高值后逐渐下降,在第6d又开始逐渐升高,并且SMPV-11组的表达量也高于MEVB-F61组。本研究为MEV感染水貂后机体外周血细胞因子动态变化的研究提供理论基础。为了研究水貂肠炎病毒感染水貂后病毒在水貂体内的分布情况,设计了两个试验,首先研究水貂细小病毒强毒株SMPV-11口服感染水貂后的病理变化、白细胞变化和病毒在体内不同器官分布情况等;同时另一个试验研究了弱毒疫苗株MEVB-F61注射感染水貂后的病毒在体内不同器官分布规律、白细胞变化。结果表明,SMPV-11感染后,水貂表现出严重的临床特征,如食欲废绝、体温升高及血便等症状,剖检可见肠系膜淋巴结、脾脏和肝脏肿大有出血点、肠道出血和肠壁变薄等症状,感染24h后,在各组织脏器中可以检测到病毒,并且在4d~6d MEV载量维持较高水平。MEVB-F61感染后,未发现主要的临床症状,剖检未见明显的病理变化特征,病毒载量检测显示,在脑、肾脏和肺脏中未检测到MEV的存在,而且在其它组织中,病毒载量均较低,在第15d心、肝和肠道等脏器中已检测不到MEV。在4d~8d是SMPV-11组和MEVB-F61水貂的排毒量高峰时段,表明此时段是病毒向外界扩散最严重时期,并且两个毒株在肠道和淋巴组织和脾脏中含量最高,印证了肠道、肠系膜淋巴结和脾脏等是MEV主要的靶器官。对MEV在临床特征、病理变化和病毒体内分布的研究,有利于MEV感染水貂的致病机理的进一步研究,也为MEV弱毒疫苗的免疫研究奠定理论基础。