论文部分内容阅读
土贝母[Bolbostemma paniculatum(Maxim)Franquet(Cucurbitaceae)]是一种传统中药，土贝母苷甲(下称苷甲)是从生药土贝母块茎中分离得到的抗微管活性成分。
目的：
本研究旨在从土贝母皂苷中分离得到较纯的土贝母苷甲，研究苷甲对人低分化上皮样鼻咽癌细胞(CNE-2Z)的影响以及苷甲的体外抗微管作用，确定苷甲与微管蛋白的结合位点。
方法：
1．采用AKTA explorer 100快速纯化工艺开拓系统，从土贝母皂苷中分离得到苷甲，并采用HPLC法检测所得苷甲的纯度；
2．采用薄层层析检测苷甲是否进入CNE-2Z细胞；采用细胞骨架抽提法观察苷甲对鼻咽癌细胞CNE-2Z细胞骨架的影响；
3．采用在高摩尔浓度的PIPES缓冲液中经两个高温聚合—低温解聚循环提取猪脑微管蛋白，Lowry′s法测定微管蛋白浓度，SDS-PAGE结合Western blotting法鉴定微管蛋白的纯度。采用浊度分析法分析苷甲对离体条件下谷氨酸诱导微管蛋白聚合的影响；
4．通过竞争性抑制试验检测苷甲对已知配基与微管蛋白结合的抑制能力。
结果：
1．HPLC法检测所得苷甲的纯度为98.2％；
2．苷甲进入了CNE-2Z细胞内，破坏了CNE-2Z细胞微管网络；
3．所得猪脑微管蛋白的浓度为10.04mg/ml，纯度>98％。证实苷甲抑制了离体条件下猪脑微管蛋白的聚合：
4．苷甲不抑制长春碱与微管蛋白的结合；苷甲竞争性抑制秋水仙碱与微管蛋白结合。
结论：
苷甲能抑制微管蛋白的聚合，是一种微管抑制剂。苷甲与微管蛋白的结合位点在秋水仙碱结合位点，即β-微管蛋白354半胱氨酸。