【摘 要】
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乳酸菌是一类可代谢碳水化合物产生乳酸的细菌统称。乳酸菌在自然界和人体中分布极为广泛,具有丰富的物种多样性,因其具有拮抗致病菌、增强免疫功能、加强肠道屏障和调节肠道菌群等功能而具有良好的应用前景,有望成为安全、稳定和经济的生物抗菌剂。本研究在中国、埃及和斯里兰卡三个国家采集发酵食品和人源粪便样本,并从中分离获得509株乳酸菌;基于509株乳酸菌筛选得到具有优良抗菌活性、生长特性、益生特性和安全特性的
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乳酸菌是一类可代谢碳水化合物产生乳酸的细菌统称。乳酸菌在自然界和人体中分布极为广泛,具有丰富的物种多样性,因其具有拮抗致病菌、增强免疫功能、加强肠道屏障和调节肠道菌群等功能而具有良好的应用前景,有望成为安全、稳定和经济的生物抗菌剂。本研究在中国、埃及和斯里兰卡三个国家采集发酵食品和人源粪便样本,并从中分离获得509株乳酸菌;基于509株乳酸菌筛选得到具有优良抗菌活性、生长特性、益生特性和安全特性的戊糖片球菌IM96;进一步利用肠出血性大肠杆菌O157:H7感染小鼠模型,从肠道免疫、肠道屏障和肠道菌群等方面探索菌株IM96在体内对感染小鼠的保护作用及其抗感染机制。主要结果如下:（1）于中国、埃及和斯里兰卡三个国家采集食品样本和人体粪便样本,利用16S r RNA基因扩增子测序方法分析发酵乳制品中微生物群落结构的组成。基于样本基因组学信息,利用纯培养技术选择性分离样本中的乳酸菌。经过对样本进行菌种富集、分离、纯化并鉴定,最后获得509株乳酸菌,包含16个属,41个种。（2）通过抗菌实验从509株乳酸菌中筛选出具有广谱抗菌活性的菌株,在体外探究影响其抗菌活性的因素和抗菌机制。以9种常见的食源性致病菌作为指示菌进行抗菌实验,筛选获得3株具有广谱抗菌活性的乳酸菌:戊糖片球菌IM96、植物乳杆菌EG3和唾液乳杆菌MZ84。以肠出血性大肠杆菌O157:H7 ATCC 43895（Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 ATCC 43895,简称EHEC O157:H7）和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌Sta396（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus Sta396,简称MRSA Sta396）作为指示菌探究乳酸菌抗菌活性的影响因素,结果显示发酵温度、发酵时间及碳源种类能够影响菌株的抗菌活性,且具有明显的菌株特异性。体外抗菌机制探究中发现,3株乳酸菌发酵上清液均可抑制EHEC O157:H7和MRSA Sta396的生长繁殖。利用扫描电镜观察发现,EHEC O157:H7经过3株菌发酵上清液作用后,细胞完整性及形态发生改变,细胞壁破裂形成孔洞。3株菌均可通过竞争、置换和排斥方式抑制EHEC O157:H7黏附Caco-2细胞,其中菌株IM96具有最佳的抑制活性,3种方式的抑制率分别为33.90±8.50%、45.55±9.15%和27.70±7.46%。（3）探究3株具有抗菌活性乳酸菌的生长特性及其最佳发酵工艺,同时对其益生特性和安全特性进行评估,为进一步研究与应用奠定基础。结果表明3株菌具有生长速度快和发酵菌体量大的特点,在pH范围为5-8和温度范围为37-42℃的条件下均可稳定快速生长。在产酸特性上,3株菌均可代谢产生苹果酸、乳酸、乙酸、丁二酸和丙酸。此外,3株菌均具有良好的胃肠液耐受性,存活率均在75%以上。在对Caco-2细胞的黏附能力方面,菌株IM96具有最高的黏附能力,黏附率为13.21±2.14%。基因组信息和耐药分析结果显示菌株IM96和MZ84均未发现毒力基因和耐药基因,同时对抗生素敏感和无溶血性。综合三株菌的抗菌活性、生长特性、益生特性和安全特性,选取菌株IM96进行下一步的体内抗菌机制研究。（4）利用EHEC O157:H7感染小鼠模型,从体内探索戊糖片球菌IM96对感染小鼠的保护作用及其抗感染机制。结果表明菌株IM96通过多种方式增强小鼠抗感染能力。菌株IM96能够下调空肠中促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平,上调抗炎因子IL-10水平以减轻肠道炎症;通过增加空肠中黏蛋白2（Mucin-2,MUC-2）的浓度、杯状细胞数量和紧密连接蛋白Occludin和紧密连接蛋白-1（Zonula occluden-1,ZO-1）的表达以增强肠道上皮屏障功能。此外,菌株IM96还能调节肠道菌群,维持群落结构的平衡,提高肠道短链脂肪酸的浓度以发挥抵抗EHEC O157:H7侵袭的作用。综上所述,戊糖片球菌IM96具有优良的抗菌活性、生长特性、益生特性和安全特性。进一步研究结果表明戊糖片球菌IM96可通过抑制EHEC O157:H7的生长繁殖及黏附、降低肠道炎症、增强肠道屏障功能和调节肠道菌群在体内外发挥对EHEC O157:H7的拮抗作用。
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