论文部分内容阅读
以汕油523花生(Arachis hypogaea L.)10 d龄幼叶中部区段作为外植体,初步确定诱导的愈伤组织为胚性愈伤组织。最佳的诱导培养基为MS+TDZ(0.1 mg/L)+2,4-D(1.0 mg/L)。
通过TDZ(thidiazuron)和2,4-D(2,4-dichlorophenoxya cetic acid)两种植物生长调节剂的不同浓度配比诱导花生胚性愈伤组织,发现在培养基MS+TDZ(0.1 mg/L)+2,4-D(1.0 mg/L)中诱导出淡黄色、愈伤表面呈松脆颗粒状,从外部形态初步确定其为拟胚性愈伤组织；光学显微镜下观察,发现拟胚性愈伤组织诱导的悬浮细胞为圆形,非胚性愈伤组织诱导的细胞呈细长形；拟胚性愈伤组织细胞的淀粉粒含量显著多于非胚性愈伤组织细胞,由此可初步确定其为胚性愈伤组织。
以胚性愈伤组织作为工程农杆菌介导的遗传转化的基因受体,农杆菌浸染后,外植体全部褐化死亡,无法获得抗性胚性愈伤组织。为顺利进行花生转基因的研究,选择带胚的花生种子作为农杆菌介导遗传转化的外植体。在实验室前期研究的基础上,将PI、2s-4b和2s-5b基因3个目的基因分别与真核表达载体pCAMBIA1303连接,转化子经抗性筛选、PCR鉴定、双酶切鉴定和测序鉴定,结果证明真核表达载体35S::PI、35S::2s-4b::GUS和35S::2s-5b::GUS构建成功,并成功制备工程农杆菌。
在9个农杆菌浸染条件组合中,其中OD600为0.6的农杆菌EHA105浸染花生含胚端的半粒种子30 min,该组合浸染效果最好。以35 mg/L的Hyg B(Hygromycin B)筛选抗性芽,经PCR分子水平鉴定和GUS检测,可初步确定获得阳性转基因植株,其中PCR检测51株转2s-4b基因筛选苗,19株呈阳性,GUS检测阳性率约33％；在另外两个目的基因的转化中,均使用上述浸染条件,经鉴定获得转基因苗,其中获得8株转2s-5b基因苗,6株转PI基因苗；及通过Sq RT-PCR法,证明转PI基因的花生苗中PI基因的相对表达量比对照组的量大。
本实验利用农杆菌介导的遗传转化转基因技术将抗病抗虫基因整合到花生外植体中,使目的基因在转基因花生植株中过量表达。