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目的
据2020年全球癌症统计报告显示，卵巢癌(ovarian cancer，OC)是世界范围内妇科恶性肿瘤的第二大死亡原因。虽然人们已经做了大量的工作来阐明其病因，但分子机制仍不清楚。为了鉴定卵巢癌发生和进展过程中的候选基因，利用生物信息学方法，筛选差异表达基因(differentially expressed genes，DEGs)。其中人单级纺锤体1(human monopolar spindle 1，MPS1)，也称丝氨酸/苏氨酸和酪氨酸激酶(threonine and tyrosine kinase，TTK)表达情况与卵巢浆液性癌患者生存预后之间的关系及生物学功能并不明确。本课题旨在研究TTK表达与卵巢癌患者预后的关系及其在卵巢癌中的生物学功能。
方法
利用R语言从肿瘤基因组图谱(The Cancer Genome Atlas，TCGA)数据库获取362个卵巢癌病人和组织基因型表达(Genotype-Tissue Expression，GTEx)数据库中获取180个正常人的mRNA转录组数据。通过R语言中tidyverse软件包筛选差异表达基因(differentially expressed genes DEGs)，ggplot2软件包对DEGs进行可视化，利用clusterProfiler软件包对筛选出的DEGs进行基因本体论(Gene Ontology，GO)功能注释和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析。利用检索相互作用基因的搜索工具(Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes，STRING)构建蛋白-蛋白相互作用网络(protein-protein interaction，PPI)。利用Cytoscape的分子复合物检测(Molecular Complex Detection，MCODE)插件识别PPI网络的关键基因。通过对各关键基因的背景调查，最后确定所研究的目的基因TTK。通过基因表达谱分析(Gene Expression Profiling Interactive Analysis，GEPIA2)和Kaplan-MeierPlotter绘制目的基因TTK在各种肿瘤组织中的基因表达谱和在肺腺癌、食管癌、甲状腺癌、乳腺癌、宫颈鳞癌、子宫内膜癌病人中的生存曲线。使用GEPIA2分析TTK在卵巢癌和正常卵巢组织中的表达情况。
通过Kaplan-MeierPlotter分析TTK与卵巢高级别浆液性癌(high grade serous ovarian cancer，HGSOC)患者预后的相关性。进一步以HGSOC为研究对象，收集山东大学齐鲁医院妇产科术前未进行先期化疗的HGSOC患者的肿瘤组织标本及临床病理学信息。采用免疫组化检测TTK蛋白在HGSOC中的表达水平，采用免疫组化染色结果的中位数为截断值，作为判定TTK高、低表达水平的界值。通过Fisher精确检验、Spearman相关系数、非参数秩和检验和Cox风险回归模型分析TTK表达水平与临床特征的关系以及TTK表达水平与患者生存预后的关系，从而研究TTK是否是卵巢浆液性癌的预后相关因子。
通过定量逆转录PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)、WesternBlot检测卵巢癌细胞系中TTKmRNA、蛋白质的表达情况。通过慢病毒转染HEY细胞系，构建过表达细胞系，小干扰RNA(Small interfering RNA，siRNA)转染SKOV3细胞系，从mRNA、蛋白质水平验证其转染效率后进行细胞增殖检测CCK-8实验、单克隆形成实验、EdU细胞增殖实验。所有实验均进行3次独立重复。数据使用均值±标准差来表示。应用GraphPadPrism9.0.0，对于两组独立样本，使用独立样本t检验，多组样本符合正态分布，则采用方差分析，不符合正态分布采用非参数检验。
结果
1.共鉴定出996个DEGs基因，其中587个基因表达上调，409个基因表达下调。GO富集分析中细胞定位显示DEGs主要位于细胞间连接、含胶原的细胞外基质、紧密连接、角质套膜、高尔基顺面膜囊;分子功能主要集中在信号受体激活剂的活性、受体配体活性、丝氨酸水解酶活性、丝氨酸型内肽酶活性、丝氨酸型肽酶活性等;生物学过程中多调控表皮发育、核分裂、皮肤发育、染色体分离、角质化等。通路分析表明这些基因主要富集于介导钙信号通路、细胞周期、神经活动配体受体相互作用、胰腺分泌、PI3K-Akt信号通路等。选择PPI评分最高的第一组关键基因(hub gene)进行分析，共18个，通过国内外文献检索，分别进行背景调查，最终确定了所要研究的目的基因TTK。基于对数据库的分析显示TTK在绝大多数肿瘤中存在表达差异，且在肺腺癌、食管癌、甲状腺癌、乳腺癌、宫颈鳞癌、子宫内膜癌等肿瘤中表达情况与患者预后相关，高表达预后差，低表达预后好，而TTK在卵巢癌组织和正常卵巢组织中表达也具有差异。鉴于TTK在其他恶性肿瘤中与患者预后明显相关，且其抑制剂的开发及Ⅰ期临床实验的效果，显示了部分对抗肿瘤细胞微管形成药物增敏的作用以及肿瘤疫苗的研发，也更加速了TTK在卵巢癌中研究的迫切需要，即TTK在卵巢癌中的表达情况、生物学功能以及与卵巢癌患者预后的具体情况还有待后续进一步验证。
2.数据库中显示，在HGSOC的患者中，TTK表达量与患者的总生存期(overall survival，OS)无显著相关性(p=0.39)，风险比(hazard ratio，HR)为1.07，95％置信区间(confidence interval，CI)为0.92-1.25。免疫组化实验显示TTK蛋白染色范围为细胞浆和细胞核，但主要集中于细胞浆，高表达比例为42％(13/31)。TTK在HGSOC组织中蛋白表达明显高于对侧正常卵巢组织，Fisher精确检验结果表明TTK高表达和低表达两组在患者年龄、CA125水平、肿瘤最大直径、国际妇产科联合会(Federation International of Gynecology and Obstetrics，FIGO)分期、腹水、残留病灶、盆腔淋巴结状态、患者生存状态方面的差异不具有统计学意义(p均＞0.05)。Spearman相关性分析示，TTK表达水平与患者年龄、肿瘤最大直径、残留病灶呈现负相关，与CA125水平、FIGO分期呈现正相关，但均不具有统计学意义(p均＞0.05)。单因素Kaplan-Meier分析结果显示，TTK表达量(p=0.036)和FIGO分期(p=0.008)与HGSOC患者的OS显著相关。单因素COX回归分析同样显示，TTK表达量(p=0.044)、FIGO分期(p=0.030)与患者OS显著相关。而与患者年龄、CA125表达水平、肿瘤大小、是否伴有腹水，残余病灶、淋巴结转移和患者OS的相关性无统计学意义(p＞0.05)。多因素COX回归分析结果示，FIGO分期对HGSOC患者的OS存在显著性影响(p=0.035)，HGSOC患者Ⅲ-Ⅳ期的死亡风险是Ⅰ-Ⅱ期的8.904倍，是其独立影响因素，TTK表达量不是HGSOC患者OS的独立影响因素。
3.通过RT-PCR、WesternBlot实验验证TTK在卵巢癌细胞系中mRNA、蛋白质的表达情况。慢病毒转染细胞，构建过表达细胞系，瞬时转染细胞来沉默基因TTK。在细胞增殖检测CCK-8实验、单克隆形成实验、EdU细胞增殖实验中可见:过表达TTK可明显促进细胞增殖，而沉默TTK对细胞增殖有显著的抑制作用。
结论
1.卵巢癌组织与正常卵巢组织表达的差异基因中，BIRC5、CDC20、TPX2、UBE2C、KIAAO101、TTK、MELK、TOP2A、DLGAP5、RRM2、AURKB、NEK2、HJURP、CEP55、PBK、MKI67、KIF18B、DEPDC1共18个基因是卵巢癌潜在的生物标志物。
2.TTK基因在卵巢癌组织较正常组织中高表达。
3.TTK高表达与患者不良预后相关。
4.TTK高表达促进细胞增殖，低表达抑制细胞增殖。
5.TTK可能参与了卵巢癌的癌变，极有可能成为卵巢癌诊断和治疗的候选靶点。
据2020年全球癌症统计报告显示，卵巢癌(ovarian cancer，OC)是世界范围内妇科恶性肿瘤的第二大死亡原因。虽然人们已经做了大量的工作来阐明其病因，但分子机制仍不清楚。为了鉴定卵巢癌发生和进展过程中的候选基因，利用生物信息学方法，筛选差异表达基因(differentially expressed genes，DEGs)。其中人单级纺锤体1(human monopolar spindle 1，MPS1)，也称丝氨酸/苏氨酸和酪氨酸激酶(threonine and tyrosine kinase，TTK)表达情况与卵巢浆液性癌患者生存预后之间的关系及生物学功能并不明确。本课题旨在研究TTK表达与卵巢癌患者预后的关系及其在卵巢癌中的生物学功能。
方法
利用R语言从肿瘤基因组图谱(The Cancer Genome Atlas，TCGA)数据库获取362个卵巢癌病人和组织基因型表达(Genotype-Tissue Expression，GTEx)数据库中获取180个正常人的mRNA转录组数据。通过R语言中tidyverse软件包筛选差异表达基因(differentially expressed genes DEGs)，ggplot2软件包对DEGs进行可视化，利用clusterProfiler软件包对筛选出的DEGs进行基因本体论(Gene Ontology，GO)功能注释和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析。利用检索相互作用基因的搜索工具(Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes，STRING)构建蛋白-蛋白相互作用网络(protein-protein interaction，PPI)。利用Cytoscape的分子复合物检测(Molecular Complex Detection，MCODE)插件识别PPI网络的关键基因。通过对各关键基因的背景调查，最后确定所研究的目的基因TTK。通过基因表达谱分析(Gene Expression Profiling Interactive Analysis，GEPIA2)和Kaplan-MeierPlotter绘制目的基因TTK在各种肿瘤组织中的基因表达谱和在肺腺癌、食管癌、甲状腺癌、乳腺癌、宫颈鳞癌、子宫内膜癌病人中的生存曲线。使用GEPIA2分析TTK在卵巢癌和正常卵巢组织中的表达情况。
通过Kaplan-MeierPlotter分析TTK与卵巢高级别浆液性癌(high grade serous ovarian cancer，HGSOC)患者预后的相关性。进一步以HGSOC为研究对象，收集山东大学齐鲁医院妇产科术前未进行先期化疗的HGSOC患者的肿瘤组织标本及临床病理学信息。采用免疫组化检测TTK蛋白在HGSOC中的表达水平，采用免疫组化染色结果的中位数为截断值，作为判定TTK高、低表达水平的界值。通过Fisher精确检验、Spearman相关系数、非参数秩和检验和Cox风险回归模型分析TTK表达水平与临床特征的关系以及TTK表达水平与患者生存预后的关系，从而研究TTK是否是卵巢浆液性癌的预后相关因子。
通过定量逆转录PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)、WesternBlot检测卵巢癌细胞系中TTKmRNA、蛋白质的表达情况。通过慢病毒转染HEY细胞系，构建过表达细胞系，小干扰RNA(Small interfering RNA，siRNA)转染SKOV3细胞系，从mRNA、蛋白质水平验证其转染效率后进行细胞增殖检测CCK-8实验、单克隆形成实验、EdU细胞增殖实验。所有实验均进行3次独立重复。数据使用均值±标准差来表示。应用GraphPadPrism9.0.0，对于两组独立样本，使用独立样本t检验，多组样本符合正态分布，则采用方差分析，不符合正态分布采用非参数检验。
结果
1.共鉴定出996个DEGs基因，其中587个基因表达上调，409个基因表达下调。GO富集分析中细胞定位显示DEGs主要位于细胞间连接、含胶原的细胞外基质、紧密连接、角质套膜、高尔基顺面膜囊;分子功能主要集中在信号受体激活剂的活性、受体配体活性、丝氨酸水解酶活性、丝氨酸型内肽酶活性、丝氨酸型肽酶活性等;生物学过程中多调控表皮发育、核分裂、皮肤发育、染色体分离、角质化等。通路分析表明这些基因主要富集于介导钙信号通路、细胞周期、神经活动配体受体相互作用、胰腺分泌、PI3K-Akt信号通路等。选择PPI评分最高的第一组关键基因(hub gene)进行分析，共18个，通过国内外文献检索，分别进行背景调查，最终确定了所要研究的目的基因TTK。基于对数据库的分析显示TTK在绝大多数肿瘤中存在表达差异，且在肺腺癌、食管癌、甲状腺癌、乳腺癌、宫颈鳞癌、子宫内膜癌等肿瘤中表达情况与患者预后相关，高表达预后差，低表达预后好，而TTK在卵巢癌组织和正常卵巢组织中表达也具有差异。鉴于TTK在其他恶性肿瘤中与患者预后明显相关，且其抑制剂的开发及Ⅰ期临床实验的效果，显示了部分对抗肿瘤细胞微管形成药物增敏的作用以及肿瘤疫苗的研发，也更加速了TTK在卵巢癌中研究的迫切需要，即TTK在卵巢癌中的表达情况、生物学功能以及与卵巢癌患者预后的具体情况还有待后续进一步验证。
2.数据库中显示，在HGSOC的患者中，TTK表达量与患者的总生存期(overall survival，OS)无显著相关性(p=0.39)，风险比(hazard ratio，HR)为1.07，95％置信区间(confidence interval，CI)为0.92-1.25。免疫组化实验显示TTK蛋白染色范围为细胞浆和细胞核，但主要集中于细胞浆，高表达比例为42％(13/31)。TTK在HGSOC组织中蛋白表达明显高于对侧正常卵巢组织，Fisher精确检验结果表明TTK高表达和低表达两组在患者年龄、CA125水平、肿瘤最大直径、国际妇产科联合会(Federation International of Gynecology and Obstetrics，FIGO)分期、腹水、残留病灶、盆腔淋巴结状态、患者生存状态方面的差异不具有统计学意义(p均＞0.05)。Spearman相关性分析示，TTK表达水平与患者年龄、肿瘤最大直径、残留病灶呈现负相关，与CA125水平、FIGO分期呈现正相关，但均不具有统计学意义(p均＞0.05)。单因素Kaplan-Meier分析结果显示，TTK表达量(p=0.036)和FIGO分期(p=0.008)与HGSOC患者的OS显著相关。单因素COX回归分析同样显示，TTK表达量(p=0.044)、FIGO分期(p=0.030)与患者OS显著相关。而与患者年龄、CA125表达水平、肿瘤大小、是否伴有腹水，残余病灶、淋巴结转移和患者OS的相关性无统计学意义(p＞0.05)。多因素COX回归分析结果示，FIGO分期对HGSOC患者的OS存在显著性影响(p=0.035)，HGSOC患者Ⅲ-Ⅳ期的死亡风险是Ⅰ-Ⅱ期的8.904倍，是其独立影响因素，TTK表达量不是HGSOC患者OS的独立影响因素。
3.通过RT-PCR、WesternBlot实验验证TTK在卵巢癌细胞系中mRNA、蛋白质的表达情况。慢病毒转染细胞，构建过表达细胞系，瞬时转染细胞来沉默基因TTK。在细胞增殖检测CCK-8实验、单克隆形成实验、EdU细胞增殖实验中可见:过表达TTK可明显促进细胞增殖，而沉默TTK对细胞增殖有显著的抑制作用。
结论
1.卵巢癌组织与正常卵巢组织表达的差异基因中，BIRC5、CDC20、TPX2、UBE2C、KIAAO101、TTK、MELK、TOP2A、DLGAP5、RRM2、AURKB、NEK2、HJURP、CEP55、PBK、MKI67、KIF18B、DEPDC1共18个基因是卵巢癌潜在的生物标志物。
2.TTK基因在卵巢癌组织较正常组织中高表达。
3.TTK高表达与患者不良预后相关。
4.TTK高表达促进细胞增殖，低表达抑制细胞增殖。
5.TTK可能参与了卵巢癌的癌变，极有可能成为卵巢癌诊断和治疗的候选靶点。