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布鲁氏菌病（Brucellosis，简称布病）是由布鲁氏菌感染引起的一种危害严重的人兽共患传染病。在世界各地广泛流行，给人类健康和畜牧业发展带来严重危害。动物感染后出现流产或不育，对畜牧业带来巨大损失;人感染主要由于食用或接触了患病动物或畜产品污染所致，感染后表现为关节炎，心内膜炎和脑膜炎等。布鲁氏菌为革兰氏阴性菌、胞内寄生菌，主要寄生于单核细胞（常为巨噬细胞）内，在细胞内生存和复制是其主要毒力特征。细菌非编码小RNA(small non-coding RNA，sRNA)是近年来在细菌中发现的一类RNA调控子，它们在应对环境变化的基因表达调控中扮演重要角色，是细菌代谢、毒力和适应环境压力的重要调控子。作用方式主要是通过碱基互补配对与靶标基因mRNA结合，影响mRNA的稳定性和翻译，进而在转录水平上调控基因表达。本研究中，我们通过单链特异性深度测序筛选了布鲁氏菌中的大量sRNA。选取30个与胞内生存相关的sRNA进行验证，并利用RT-PCR验证体外模拟细胞内环境刺激条件它们的转录情况。对其中一个涉及布鲁氏菌毒力相关的sRNA即BSR0441进行研究，并对BSR0441的靶基因进行了预测和验证，分析了BSR0441在布鲁氏菌胞内生存中的作用。 首先，标准培养条件下体外培养布鲁氏菌16M株，提取总RNA，纯化mRNA后利用dUTP第二链标记方法制备cDNA文库，PCR扩增后进行单链特异性测序，以16M基因组序列为参照对测序得到的reads进行比对，分析鉴定所有的sRNA。结果表明，reads在基因组上的覆盖度良好，总共识别了1321个sRNA，长度在100到600 nt间。这些sRNA在布鲁氏菌染色体中的分布不同，同时它们的转录水平也存在差异。RT-PCR结果显示，预测的sRNA在体外条件下都存在转录，且与布鲁氏菌胞内生存相关。运用TargetRNA2预测sRNA的靶基因，BSR0441的靶基因主要为布鲁氏菌毒力相关的转录调控因子。 为了验证测序结果的正确性，首先利用Northern blot确认BSR0441在布鲁氏菌中存在转录。qRT-PCR分析BSR0441在布鲁氏菌体外不同生长期及感染情况下的转录，结果显示其在布鲁氏菌不同生长期和小鼠感染期间都存在转录。为进一步探讨B SR0441在布鲁氏菌胞内生存和毒力中的作用，构建了BSR0441的突变株(16M-△BSR0441)和过表达株(16M-BSR0441)，并对野生株(16M)、16M-△BSR0441和16M-BSR0441的相关表型进行研究。生长曲线结果表明，BSR0441对布鲁氏菌的生长速度影响较小。在模拟巨噬细胞内环境的多种体外刺激条件下的生存能力结果表明，BSR0441缺失或过表达后在各种刺激条件的存活率降低、抵抗压力的能力下降，尤其在热应激和酸刺激下胞内存活率明显下降。巨噬细胞侵染试验结果表明，BSR0441缺失与过表达使布鲁氏菌在细胞感染期间的存活能力下降。小鼠毒力试验结果显示，感染中后期突变株的数量较野生株明显减少，表明BSR0441参与调控布鲁氏菌在体内的生存和繁殖。为进一步了解BSR0441在布鲁氏菌中的作用，我们对其靶基因进行了预测，并采用qRT-PCR分析16M、16M-△BSR0441和16M-B SR0441对5个靶基因的转录水平的影响。结果表明，在巨噬细胞和小鼠感染期间BSR0441的缺失与过表达影响了其靶基因的转录，且该sRNA同时调控多个靶基因。