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本研究采用ISSR与SRAP技术对中国热带农业科学院南亚热带作物研究所收集保存的123份澳洲坚果种质进行分析,以期从DNA水平上评价目前所收集保存的澳洲坚果资源的多样性,为我国澳洲坚果的生产及育种提供理论依据。结果如下:
(1)由于澳洲坚果成熟叶片富含多糖、多酚和多种次生物质,本研究采用改良CTAB法提取到叶片高质量的DNA,摆脱了提取澳洲坚果基因组DNA的时间限制。
(2)分别建立了澳洲坚果的ISSR及SRAP的反应体系。
最佳的ISSR反应体系为:总反应体积为25μL,包括2.5μL10xPCRbuffer,TaqDNA聚合酶1U,模板DNA20ng,dNTPs0.15mM,引物0.25μM,Mg2+2.5mM,可加入0.4%甲酰胺以减轻背景干扰。PCR.扩增程序为:94℃预变性5min:94℃变性30s,复性1min,72℃延伸2min,35个循环;72℃延伸7min,4℃保存。
最佳的SRAP反应体系为:总反应体积为25μL,包括2.5μL10xPCRbuffer,1UTaqDNA聚合酶,40ng模板DNA,0.2mMdNTPs,0.2μM引物,3.0mMMg2+。PCR.扩增程序为:94℃预变性5min;94℃变性1min,35℃复性1min,72℃延伸90s,5个循环:94℃变性1min,50℃复性1min,72℃延伸90s,35个循环;72℃延伸8min。4℃保存。
(3)从100条ISSR引物和99对SRAP引物中分别筛选出19条和30对引物对123澳洲坚果种质进行遗传多样性分析。其中ISSR.标记获得391条带,多态性位点289个,多态条带比率为73.9%;SRAP标记获得875条带,多态性位点720个,多态条带比率为82.3%。对两种标记的协表征矩阵和遗传相似系数矩阵间的相关性以及两种标记的遗传相似系数矩阵间的相关性的研究表明,两种技术的分析结果具有较高的一致性和可信度。
(4)利用两种标记得到的数据矩阵和复合数据矩阵,采用Nei&Li的方法计算出各材料间的遗传相似系数,应用UPGMA法获得聚类图。表明123份澳洲坚果种质间的亲缘关系较近,说明所收集的种质遗传基础较窄。在类群的划分上,123份材料表现出较强的地域性分化。由此推测夏威夷引入的种质与澳大利亚选育的品种具有不同的遗传背景或因环境变化发生了变异。