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日本乙型脑炎病毒(Japanese Encephalitis Virus,JEV)属于黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属,是一种典型的嗜神经病毒。该病毒主要经蚊虫传播,并严重危害人、畜健康。人类发病后死亡率高,且治愈后往往留下神经学后遗症。在猪群中,该病毒主要引起妊娠母猪流产、产死胎或木乃伊胎,公猪发生睾丸炎,育肥猪持续高热等,给养猪业造成巨大的经济损失。NS2B和NS4B蛋白是JEV的2个重要的非结构蛋白,它们的功能尚待解答。本研究旨在构建能稳定表达NS2B和NS4B蛋白的细胞系,并在此基础上,通过串联亲和层析(Tandem Affinity Purification,TAP)与质谱(Mass spectrometry analysis,MS)技术,筛选可能与它们相互作用的宿主蛋白,从而为深入阐明NS2B和NS4B的功能及其与宿主细胞相互作用机制的研究奠定基础。具体研究内容如下:1.构建细胞系利用RT-PCR方法扩增JEV NS2B和NS4B基因,并将之克隆至带嘌呤霉素(Puromycin)抗性基因的载体Psin-EF2-MCS-Pur中。然后利用慢病毒载体包装系统,与ps PAX2和p MD2.G共同转染293T细胞,收获的慢病毒粒子转导正常293T细胞,通过嘌呤霉素筛选纯化细胞系Cellline-NS2B和Cellline-NS4B。同时,用空载体包装病毒,相同方法获得对照组细胞系Cellline-vector。2.细胞系的验证对已经得到的慢病毒细胞系,采用三种方式进行验证:嘌呤霉素抗性实验;免疫荧光染色;Western blot验证。三种方法都证明了细胞系中目的蛋白能稳定、高效表达。3.筛选互作蛋白利用建立的细胞系,进行串联亲和层析实验,洗脱后的产物进行SDS-PAGE胶分离并进行银染处理,分析实验组和对照组产物条带的区别,并结合质谱分析的方法找出在293T细胞中与JEV NS2B和NS4B蛋白相互作用的宿主蛋白质。最终我们发现NS2B可能与宿主蛋白ADP/ATP转运酶2(ADP/ATP carrier protein,ANT2)相互作用。