论文部分内容阅读
猪圆环病毒(porcine circovirus，PCV)属于圆环病毒科，是一种无囊膜的二十面体的单链环状DNA病毒。该病毒分为两种基因型，即PCV-1和PCV-2。前者由Tischer等1974年在PK-15(ATCC-CCL)细胞中发现，没有致病性；后者是仔猪断奶后多系统衰竭综合征的重要病原。 设计合成一对扩增猪Ⅱ型圆环病毒(PCV-2)全基因组的特异性引物，从3份患断奶后仔猪多系统衰弱综合征(postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)的死亡仔猪病料中，PCR扩增和克隆了3株PCV-2全基因组序列。将所测序列与已公布的PCV毒株序列进行同源性比较，并绘制系统发育进化树。结果显示，所测毒株间的核苷酸同源性为95.7％-99.4％，与其它毒株的同源性较高，达95.1％以上；ORF1的核苷酸同源性高达97.8％以上，氨基酸同源性大于98％；ORF2的核苷酸同源性较低，为90％-98％不等，推导的氨基酸序列同源性介于87％-99.1％。进化树分析表明各分离毒株在进化上存在地域上的相关性。将克隆到的PCV-2基因组环化后，脂质体介导转染PK-15细胞。盲传3代。间接免疫荧光检测表明，克隆到的青岛(QD)毒株基因组具有感染性。 将克隆到的PCV-2基因组SacⅡ酶切释放，体外连接生成二聚体，然后插入pBluescript SK+载体，构建PCV-2分子克隆pSK2PCVG，脂质体介导转染PK-15细胞，间接免疫荧光检测表明，pSK2PCVG在体外具有感染性。 根据已测定的序列设计引物，PCR扩增和克隆到了ORF1基因的完整编码区段，并测定了核苷酸序列。克隆的ORF1基因全长945bp，编码314个氨基酸。进一步将此片段亚克隆到原核表达载体pET-28a和pGEX-KG中，转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株，Western印迹检测获得了分子量分别为38kD和63kD的非融合蛋白和与谷胱甘肽-S转移酶(GST)相融合的表达蛋白。 本研究克隆了3株PCV-2的全基因组，并测定了序列，通过系统进化分析表明各分离毒株在进化上存在地域上的相关性，在此基础上进一步构建了PCV-2感染性分子克隆。对ORF1基因成功的进行了原核表达。这些工作为研究PCV-2的流行和变异、探索PCV-2的致病机理、开发新的疫苗和诊断方法奠定了基础。