论文部分内容阅读
鼠伤寒沙门氏菌（S.Typhimurium）侵入宿主细胞后主要以两种方式存在，一部分沙门氏菌被沙门氏菌内含小泡（SalmonellaContaining Vacuole,SCV）包被，另一部分沙门氏菌会从破溃的SCV中逃逸出来游离于宿主细胞胞浆中，游离的沙门氏菌和破溃的SCV膜诱导宿主细胞异噬（Xenophage）的发生。本实验室前期研究发现，沙门氏菌效应蛋白SopB和SopE2能够与TRAF6互作，激活STAT3信号转导途径，诱导宿主细胞转录重编程，帮助胞内沙门氏菌的繁殖。实际上，胞内沙门氏菌的数量由两个因素决定，一个是沙门氏菌繁殖能力，一个是宿主细胞异噬作用对沙门氏菌的清除能力。但是TRAF6在沙门氏菌感染过程中，对细胞异噬的调节作用仍不清楚。
本研究首先利用免疫印迹（Western Blot）技术和实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术分析了异噬标志物LC3（Microtubule-associated proteins1A/1B light chain3）的蛋白表达以及转录水平，发现与野生型细胞相比，在TRAF6缺失细胞（Traf6-/-）中，LC3-II蛋白大量积累，LC3蛋白的转录水平却显著降低，LC3蛋白在转录水平降低、合成来源减小的前提下累积，说明TRAF6的缺失导致了沙门氏菌感染诱导的细胞异噬受阻。
为了进一步挖掘受TRAF6调控的异噬途径中的潜在靶点，使用高通量转录组测序检测了沙门氏菌感染的Traf6+/+细胞和Traf6-/-细胞在0、2和8小时的mRNA表达情况，通过对转录组数据的分组比对，差异基因筛选和KEEG富集分析发现了六个潜在基因：LC3、c-JUN（Transcription factor AP-1）、REDD1（DNAdamage-inducible transcript4protein）、DEPTOR（DEP domain-containing mTOR-interacting protein）、LAMP1（Lysosome-associated membrane glycoprotein1）、FOXO3（Forkhead box protein O3）。利用Western blot和qRT-PCR技术对除LC3外的蛋白进行蛋白和RNA水平的分析和验证。结果发现，与沙门氏菌感染的野生型细胞相比，在Traf6-/-细胞中，虽然REDD1基因转录水平增强，但是其蛋白水平无差异。而c-JUN基因与REDD1类似，虽然其转录水平降低，但是其蛋白水平无差异，表明REDD1和c-JUN不参与TRAF6调控的细胞异噬。DEPTOR蛋白是mTORC1和mTORC2的负调控因子，与野生型相比，沙门氏菌感染的Traf6-/-细胞中DEPTOR转录水平上升，但其蛋白水平下降，从而导致mTOR激活，进而异噬受阻。FOXO3是对细胞自噬起正调控作用的转录因子，与野生型细胞相比，Traf6-/-细胞中FOXO3的转录随着感染时间的延长逐渐下降，而蛋白表达在2小时短暂增加后持续下降，表明Traf6-/-缺失细胞中异噬先增强而后异噬受阻。LAMP1是溶酶体相关膜糖蛋白1，其存在于自噬溶酶体膜上，与异噬水平呈正相关。与沙门氏菌感染的Traf6+/+细胞相比，Traf6-/-细胞中LAMP1的转录和蛋白表达均是先短暂上升后持续下降，进而表明Traf6-/-缺失细胞中异噬先增强而后异噬受阻。
最后，为了进一步验证TRAF6对异噬的调控机制，利用Western blot技术检测了细胞异噬的四种衔接蛋白，分别为p62、OPTN、NBR1和NDP52。结果表明：在野生型以及Traf6-/-细胞中，p62、OPTN、NBR1三种蛋白的表达无显著差异，而Traf6-/-细胞中NDP52蛋白在沙门氏菌感染2小时后蛋白表达短暂增加后持续下降，表明在沙门氏菌感染诱导的细胞异噬中，NDP52是与TRAF6功能相关的衔接蛋白。
本研究揭示了宿主细胞通过异噬防御沙门氏菌感染的一种新机制，即宿主细胞通过TRAF6激活衔接蛋白NDP52的表达，进而正调控异噬相关蛋白DEPTOR，FOXO3，LAMP1和LC3的表达，激活宿主细胞异噬作用。这一发现为设计抗菌药物提供分子模型也为宿主定向疗法提供重要靶点和理论依据，在防治沙门氏菌病的治疗中具有积极意义。
本研究首先利用免疫印迹（Western Blot）技术和实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术分析了异噬标志物LC3（Microtubule-associated proteins1A/1B light chain3）的蛋白表达以及转录水平，发现与野生型细胞相比，在TRAF6缺失细胞（Traf6-/-）中，LC3-II蛋白大量积累，LC3蛋白的转录水平却显著降低，LC3蛋白在转录水平降低、合成来源减小的前提下累积，说明TRAF6的缺失导致了沙门氏菌感染诱导的细胞异噬受阻。
为了进一步挖掘受TRAF6调控的异噬途径中的潜在靶点，使用高通量转录组测序检测了沙门氏菌感染的Traf6+/+细胞和Traf6-/-细胞在0、2和8小时的mRNA表达情况，通过对转录组数据的分组比对，差异基因筛选和KEEG富集分析发现了六个潜在基因：LC3、c-JUN（Transcription factor AP-1）、REDD1（DNAdamage-inducible transcript4protein）、DEPTOR（DEP domain-containing mTOR-interacting protein）、LAMP1（Lysosome-associated membrane glycoprotein1）、FOXO3（Forkhead box protein O3）。利用Western blot和qRT-PCR技术对除LC3外的蛋白进行蛋白和RNA水平的分析和验证。结果发现，与沙门氏菌感染的野生型细胞相比，在Traf6-/-细胞中，虽然REDD1基因转录水平增强，但是其蛋白水平无差异。而c-JUN基因与REDD1类似，虽然其转录水平降低，但是其蛋白水平无差异，表明REDD1和c-JUN不参与TRAF6调控的细胞异噬。DEPTOR蛋白是mTORC1和mTORC2的负调控因子，与野生型相比，沙门氏菌感染的Traf6-/-细胞中DEPTOR转录水平上升，但其蛋白水平下降，从而导致mTOR激活，进而异噬受阻。FOXO3是对细胞自噬起正调控作用的转录因子，与野生型细胞相比，Traf6-/-细胞中FOXO3的转录随着感染时间的延长逐渐下降，而蛋白表达在2小时短暂增加后持续下降，表明Traf6-/-缺失细胞中异噬先增强而后异噬受阻。LAMP1是溶酶体相关膜糖蛋白1，其存在于自噬溶酶体膜上，与异噬水平呈正相关。与沙门氏菌感染的Traf6+/+细胞相比，Traf6-/-细胞中LAMP1的转录和蛋白表达均是先短暂上升后持续下降，进而表明Traf6-/-缺失细胞中异噬先增强而后异噬受阻。
最后，为了进一步验证TRAF6对异噬的调控机制，利用Western blot技术检测了细胞异噬的四种衔接蛋白，分别为p62、OPTN、NBR1和NDP52。结果表明：在野生型以及Traf6-/-细胞中，p62、OPTN、NBR1三种蛋白的表达无显著差异，而Traf6-/-细胞中NDP52蛋白在沙门氏菌感染2小时后蛋白表达短暂增加后持续下降，表明在沙门氏菌感染诱导的细胞异噬中，NDP52是与TRAF6功能相关的衔接蛋白。
本研究揭示了宿主细胞通过异噬防御沙门氏菌感染的一种新机制，即宿主细胞通过TRAF6激活衔接蛋白NDP52的表达，进而正调控异噬相关蛋白DEPTOR，FOXO3，LAMP1和LC3的表达，激活宿主细胞异噬作用。这一发现为设计抗菌药物提供分子模型也为宿主定向疗法提供重要靶点和理论依据，在防治沙门氏菌病的治疗中具有积极意义。