核酸印迹材料的制备及其检测食源性致病菌的研究

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如今,食品安全问题越发被人们关注,食源性致病菌引起的食源性疾病问题是其中的重点。食源性疾病会对人体产生一定的危害,严重时甚至可以威胁生命。食品安全的检测技术,特别是对食源性致病菌进行相对准确的检测和鉴定,是保证食品安全和公共卫生的关键性手段。传统的微生物检测方法耗时长,效率低;基于免疫学、分子生物学的新型的检测技术面临着操作复杂,试剂昂贵,灵敏度低的相关问题。因此快速、简便、准确的食源性致病菌的检测技术的开发是现在研究的热点。ZIFs材料结合了化学和热稳定性的经典沸石特性以及传统MOFs的丰富的拓扑多样性和孔径可调节性,并已广泛用作传感器的探针。
  在本课题的研究中,为了实现食源性致病菌的检测,提出将ZIFs材料作为载体,核酸适配体作为生物识别原件,淀粉分子作为生物敏感材料并起到指示剂的作用,将ZIFs纳米材料的高孔隙率和结构可调节性与核酸适配体的高亲和性、高灵敏度相结合,通过淀粉分子与碘生成包合物的显色反应,开发一种利用生物比色传感进行可视化的检测技术。主要内容如下:
  (1)在第二章和第三章中,实验通过“超声-搅拌法”制备了由金属离子(Zn2+)及配体(咪唑-2-甲醛)配位形成的纳米级有机配体骨架,称为ZIF-90。选择三种淀粉作为生物敏感分子,分别是可溶性淀粉、水溶性淀粉和糊精,统称为X。设计并实现了ZIFs纳米材料与生物敏感分子的结合,并通过“一锅合成法”制备了核壳材料X@ZIF-90,并对X@ZIF-90进行相关表征,证明了X@ZIF-90的成功合成。
  (2)在第四章中,设计并实现了ZIFs纳米材料、生物敏感分子和核酸适配体的结合,制备核酸印迹型复合纳米材料,并将其作为一种信号放大的手段,实现目标物miR-21的灵敏检测。具体的策略是:首先将淀粉分子包封进ZIF-90内制备了X@ZIF-90(分别为可溶性淀粉@ZIF-90,水溶性淀粉@ZIF-90以及糊精@ZIF-90)。接下来利用PEI进行表面修饰以减少假阳性,提高灵敏度。然后通过静电吸附作用将适配体miR-21'与X@ZIF-90-PEI组装为三种核酸印迹型复合纳米探针;加入目标物miR-21后,miR-21与miR-21'进行杂交并脱离X@ZIF-90-PEI表面,使得淀粉位点得以暴露。最后加入碘液进行显色反应,实现目标物miR-21的可视化检测。其中可溶性淀粉@ZIF-90及水溶性淀粉@ZIF-90所形成的复合纳米探针对miR-21的检测能力优于糊精@ZIF-90。线性范围为60nM-180nM、60nM-180nM,检测限为20nM、20nM。
  (3)在第五章中,选择沙门氏菌的IS200基因片段和大肠杆菌O157:H7的eaeA基因片段作为目标物,目标物相应的适配体表示为IS200'和eaeA'。将适配体与X@ZIF-90-PEI组合为六种核酸印迹型复合纳米探针。通过适配体与目标物的杂交,以及后续产生的淀粉与碘的显色反应,成功实现对食源性致病菌目标物的可视化快速检测。对于IS200来说,可溶性淀粉@ZIF-90及水溶性淀粉@ZIF-90所形成的复合纳米探针检测能力优于糊精@ZIF-90。检测范围为50-270nM、50-270nM,线性范围为50-250nM、90-270nM,检测限为50nM、50nM。对eaeA来说,可溶性淀粉@ZIF-90所形成的复合纳米探针的检测能力较为优秀。检测范围为40-180nM,线性范围为40-180nM,检测限为40nM。
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