【摘 要】
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目的 离体条件下将HIF-1α基因转染原代培养的大鼠骨骼肌细胞,观察转染后细胞上清液中VEGF的表达及其对原代培养内皮细胞增殖的影响。 方法 1.取出生3天以内的Wistar大鼠双下
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目的 离体条件下将HIF-1α基因转染原代培养的大鼠骨骼肌细胞,观察转染后细胞上清液中VEGF的表达及其对原代培养内皮细胞增殖的影响。 方法 1.取出生3天以内的Wistar大鼠双下肢肌肉,利用酶消化法和差速贴壁法分离骨骼肌细胞。通过倒置相差显微镜观察培养细胞的生长状态,采用Desmin免疫组化、α-sarcometric actin免疫细胞化学法鉴定培养细胞类型及纯度,透射电镜观察细胞超微结构和骨骼肌细胞特征;取120g左右Wistar大鼠胸主动脉以贴块法培养内皮细胞,并经过八因子相关抗原免疫细胞化学法鉴定。 2.提取和扩增pHOX/HIF-1α质粒,并经酶切和测序鉴定;以阳离子脂质体(LipofectamineTM 2000)介导pHOX/HIF-1α质粒转染骨骼肌细胞并计算转染效率;ELISA检测转染后VEGF蛋白在细胞内的表达及细胞外的分泌情况;将转染质粒后的骨骼肌细胞所表达的VEGF蛋白加入血管内皮细胞的培养液中,用MTT法检测其对内皮细胞增殖的促进作用。 结果 1.成功培养出大鼠的骨骼肌细胞和内皮细胞,并经免疫组化、免疫细胞化学和透射电镜鉴定证实。 2.成功将HIF-1α基因转染大鼠的骨骼肌细胞,荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白的表达;在转染组细胞培养上清中检测到VEGF表达,24h、48h、72h、96h浓度分别为1308.40±102、1449.2±69.86、1802.3±96.71、1494.95±86.24(pg/ml),明显高于对照组(P<0.01);转染后骨骼肌细胞分泌的VEGF具有正常促内皮细胞增殖的功能。转染后骨骼肌细胞分泌的VEGF对原代培养的血管内皮细胞生长有显著的促增殖作用,并呈剂量依赖性。在10-100pg范围内,加入
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