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本课题组以前的研究显示,CNB(Calcineurin subunit B)具有抗肿瘤效果,同时可促进脾细胞和巨噬细胞的增殖；整合素CD11b/CD18是CNB在小鼠腹腔巨噬细胞上的受体。这些研究共同表明CNB很可能通过先天免疫系统中的巨噬细胞发挥抗肿瘤作用,因此本文选用单核巨噬细胞Raw264.7做为实验细胞来研究CNB发挥抗肿瘤作用的机制,并通过一系列实验,初步描摹了CNB诱导TRAIL,表达上调的信号通路,又通过进一步的细胞和动物实验,初步探索了TRAIL在CNB抗肿瘤中的作用。
本文首先比较了CNB与多种对照蛋白对单核巨噬细胞Raw264.7中TRAIL表达的影响,证实RNA和蛋白水平上CNB都可显著诱导TRAIL表达上调,并显现出剂量依赖性,RNA水平约在50μg/ml达到峰值,蛋白水平约在40μg/ml达到峰值。同时因本文所用的所有CNB蛋白均为本实验室独自分离纯化,又通过蛋白酶K法和Polymyin B法基本排除了CNB蛋白样品中内毒素的干扰,进一步证实CNB蛋白诱导TRAIL表达上调的作用与LPS无关。在此基础上,使用CD11b的封闭型抗体可降低CNB对TRAIL的诱导作用约70％；CD11b的siRNA的干扰效率可达到80％,通过干扰CD11b的表达,可降低50％的CNB的诱导作用；但干扰CD11b并未减弱IFN-γ对TRAIL的诱导作用。这证实了在RAW264.7细胞中,CNB上调TRAIL表达依赖于整合素CD11b,而IFN-γ的诱导作用却不依赖于CD11b,表明CNB与IFN-γ二者诱导TRAIL表达上调可能经历了不同的信号转导通路。同时,通过免疫印迹发现,CNB作用后可迅速引起Raw264.7细胞中IκB-α的磷酸化(3min),并在约30min时IκB-α的磷酸化达到峰值,表明CNB可迅速引起Raw264.7细胞中NF—κB的活化。又使用NF-κB的两种抑制剂PDTC和Bay11-7082可分别降低CNB对TRAIL的诱导作用约70％和98％,并且都表现出明显的剂量依赖性。而特异性较强的siRNA对p65的干扰效率达50％,同时可降低CNB的诱导作用约60％,抑制剂抑制实验和siRNA干扰实验共同表明RAW264.7细胞中,CNB对TRAIL的诱导表达依赖于NF-κB的活化。
下一个实验部分,首先通过细胞共培养的方式构建体外杀伤模型,证实了CNB作用后的RAW264.7细胞可显著诱导H22肝癌细胞发生凋亡,峰值凋亡率为27％,比本底凋亡率高17％。另外,通过构建小鼠H22肝癌腹水瘤模型,证实CNB可以显著延长荷H22腹水瘤的BALb/c小鼠的生存期,且其治疗效果与IFN-γ的效果基本相近。这两个实验虽未直接证实TRAIL在CNB抗肿瘤中的作用,但可为进一步的研究提供实验模式上的参考。