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4-1BB(ILA，CD137)属肿瘤坏死因子受体(TNFR)家族成员，蛋白分子为含254个氨基酸的Ⅰ型跨膜糖蛋白，分子量为30kDa。其基因定位于人1p36。人4-1BB可诱导性表达在活化的T淋巴细胞（CD4+、CD8+T细胞）、B淋巴细胞、单核细胞上，组成性表达于DC上。T细胞上的4-1BB配基化所介导的正向信号可以诱导T细胞活化、增殖、分泌细胞因子，机制是通过4-1BB传递的信号抑制活化诱导的细胞死亡(AICD)。而表达在T细胞上的4-1BBL与4-1BB蛋白作用后向细胞内传递的逆向信号可抑制活化的T淋巴细胞增殖，诱导T细胞凋亡。与T细胞相反，持续表达在人外周血单核细胞上的4-1BBL分子与4-1BB作用产生的逆信号可致单核细胞活化。4-1BB诱导人外周血单核细胞增殖的能力在其他已知的分子都不具有，被认为是一种新的单核细胞活化和增殖因子。通过增强共刺激信号，有利于肿瘤的排斥和肿瘤细胞的杀伤;而阻断共刺激信号，则可诱导T细胞特异性免疫耐受的产生，有助于自身免疫性疾病或超敏反应及异体移植排斥的防治。抗4-1BB mAb能诱导CD8+CTL介导的抗肿瘤免疫，能消除业已存在的肿瘤，在小鼠心脏和皮肤模型中用激发型抗4-1BB mAb处理导致同种移植排斥，而阻断4-1BB/4-1BBL相互作用可以提高移植物的存活时间。因此，研制抗人4-1BB分子的功能性单克隆抗体并研究其生物学功能，具有重要的理论研究和应用价值。 一、人4-1BB转基因细胞的构建及体外生物学功能的研究 采用PCR方法从活化的外周血T淋巴细胞中扩增出人4-1BB基因，继而通过双酶切装入逆转录病毒载体pGEZ-Term中，利用脂质体法将重组逆转录病毒载体与两个辅助病毒载体共转染包装细胞293T，用含有完整病毒颗粒的293T细胞的培养上清感染重新铺板的293T细胞，加入Zeocin选择性培养基进行筛选。经RT-PCR、western blotting、流式细胞仪检测等方法鉴定转基因细胞稳定性，结果表明4-1BB/293T转基因细胞能稳定表达人4-1BB蛋白。DC培养过程中，4-1BB/293T细胞与激发型CD40单抗5C11联合应用，可协同促进DCs的体外成熟，上调DCs表面分子CD80、CD83和CD86的表达。 二、鼠抗人4-1BB单克隆抗体的制备 以4-1BB/293T转基因细胞为免疫原，免疫BALB/C小鼠，采用B淋巴细胞杂交瘤技术，将免疫后小鼠的脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行杂交，采用聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)为融合剂，经HAT选择培养，以4-1BB/293T转基因细胞为抗体阳性细胞株，同时用pGEZ-Term转293T细胞(mock/293T)作为阴性对照细胞株，经免疫荧光标记分析，对抗体分泌阳性孔内细胞反复筛选并经多次克隆化培养，最终获得2株持续、稳定分泌鼠抗人4-1BB抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为6F9、7D6。经体外长期传代培养和液氮冻存后复苏，杂交瘤细胞生长良好，分泌抗体的性能稳定。采用本室建立的腹水诱生和纯化方案，腹水形成的阳性率为80％，腹水的产量平均为5ml/只小鼠。免疫荧光法分析表明mAb6F9腹水型单抗的效价为1∶5000，mAb7D6的效价为1∶10000。经Protein G亲和层析纯化抗体，抗体的蛋白含量平均为1mg/ml以上。快速定性试纸分析结果显示，6F9为IgG2a亚类，单抗7D6属IgG2a亚类，轻链均为κ链。核型分析结果显示，6F9和7D6杂交瘤细胞株染色体数目超过小鼠体细胞染色体数目，表明6F9和7D6为融合体。竞争抑制试验结果显示，抗体6F9和7D6都不能阻断标准mAb4-1BB-PE（美国BD Pharmingen公司，克隆号C65-485）与4-1BB/293T细胞表面4-1BB分子的结合，这表明这两株单抗是特异性抗人4-1BB单克隆抗体，与4-1BB-PE单抗识别完全不相同的抗原位点。免疫印迹(western-blotting)实验显示:抗体6F9和7D6印染的硝酸纤维膜在4-1BB/Fc（R&D Systems，克隆号:838-4B）位置出现了特异性的染色条带，大小为60KD左右，与4-1BB/Fc分子量相吻合，而在人IgG的位置上并未出现特异性的染色条带。由此可见，抗体6F9和7D6皆可特异性地识别4-1BB蛋白。4-1BB分子较高表达于上皮来源的肿瘤细胞株上如:H1299、H446、A549、Spc-A-1、Mcg803。而在B淋巴瘤细胞系中的Daudi、Raji，多发性骨髓瘤细胞系中的M5、8266、XG系列上均未检测到4-1BB的表达，4-1BB在外周血PBLs上不表达，但可诱导性表达在T细胞、单核细胞及树突状细胞上。无论在mRNA还是蛋白质水平，H1299细胞均表达4-1BB分子。抗体7D6和6F9能特异性识别H1299上表达的4-1BB分子，而商品化的4-1BB直标和间标单抗(C65-485)都不能识别H1299上表达的4-1BB分子，进一步表明6F9和7D6与C65-485识别位点不同。运用免疫组织化学技术分析单抗7D6在肺癌组织的表达，76％(20/26)阳性，而4例正常肺组织均不表达，表明单抗7D6可用于肺癌组织的检测。 三、4-1BB/4-1BB1信号对T细胞及DCs的作用的研究 光学显微镜下观察发现，抗体6F9或7D6能明显促进经激发型CD3单抗活化的T细胞增殖。AnnexinⅤ和PI双标记后，流式细胞仪分析显示T细胞的凋亡能被抗体6F9和7D6所抑制。显微镜下培养细胞形态观察和流式细胞仪检测表明，在GM-CSF和IL-4体外培养体系中，抗体6F9或7D6能协同TNF-α刺激人外周血单核细胞向DC的分化与成熟，成熟、不成熟DC上的CD80、CD83、CD86均上调表达。由此表明抗体6F9和7D6具有激发4-1BB的作用，为功能性新型单抗。 综上所述，本实验研制的特异性鼠抗人4-1BB单抗6F9和7D6能够特异性增强T细胞的免疫应答、促进DCs的成熟，在肿瘤尤其是上皮组织来源的肿瘤研究上具有潜在的发展前景。