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东方巴贝斯虫（Babesia orientalis）是一种经镰形扇头蜱传播的重要血液原虫，是由本实验室发现和命名的一个巴贝斯虫新种，主要引起水牛巴贝斯虫病。该病在我国长江以南许多省份发生和流行，临床上患病牛以高热、贫血、黄疸和血红蛋白尿等为特征，甚至引起死亡，造成重大的经济损失。本研究首先进行了B．orientalis的分子分类学研究，在此基础上建立了B．orientalis的半巢式PCR诊断方法，然后构建了B．orientalis cDNA文库，以该文库为基础，进行了B．orientalis EST序列的测定和分析，并进一步克隆和原核表达了东方巴贝斯虫热休克蛋白70（HSP70）基因。（1） B．orientalis分子分类学研究利用真核生物18S rRNA通用引物扩增了B．orientalis 18S rRNA基因。测序后BLAST分析表明该虫种属巴贝斯虫。将该基因1，700bp长片段序列与GenBank中15种已知巴贝斯虫的相应序列进行比较分析，建立系统发育树。结果表明，B．orientalis与南非未定种的巴贝斯虫亲缘关系最近，与羊巴贝斯虫亲缘关系较近，与牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫的亲缘关系较远。这一结果从分子生物学上进一步证实了东方巴贝斯虫是一独立种。（2） B．orientalis半巢式PCR诊断方法的建立与应用根据B．orientalis 18S rRNA基因V4多变区设计引物，建立了检测B．orientalis的半巢式PCR（semi-nested PCR），特异性扩增B．orientalis 18S rRNA基因257bp的片段，敏感性试验表明其敏感性达到0.00000012％。运用建立好的半巢式PCR与传统的姬姆萨染色显微镜检的方法对湖北长江以南4个巴贝斯虫病疫区121份水牛血样，385份镰形扇头蜱样品及湖北长江以北3个巴贝斯虫病非疫区71份水牛血样进行了检测，检测结果为：湖北长江以南4个疫区，血液样品镜检5份阳性，半巢式PCR 24份阳性，蜱的样品半巢式PCR 35份阳性；湖北长江以北3个非疫区镜检梨形虫17份阳性，半巢式PCR未检测到阳性样品。针对上述检测结果，利用18S rRNA通用引物扩增非疫区的17份阳性模板，测序后分析均为泰勒虫。实验结果表明：本试验建立的B．orientalis半巢式PCR检测方法具有很高的特异性和敏感度，是一个快速有效的检测方法。从流行病学调查的结果显示：B．orientalis在湖北长江以南广泛分布，流行严重。（3） B．orientalis cDNA文库的构建利用E．Z．N．ATM Blood RNA Kit提取纯化的红细胞期B．orientalis的总RNA，利用SMARTTM cDNA Library Construction Kit反转录合成cDNA第一链，LD-PCR扩增长片段cDNA，连接λTriplEx2噬菌体载体，利用Gigapack?ⅢGold Packaging Kit体外包装，构建了B．orientalis cDNA文库。对原初文库及扩增文库的质量和滴度的监测表明：文库的插入片段在0.5～3.0kb之间，蓝白斑实验表明其重组率约98.8％，原初文库的滴度为2.0×106pfu／mL，扩增文库的滴度为5.8×108pfu／mL。结果表明：成功的构建了B．orientalis cDNA文库。利用制备的抗B．orientalis兔血清对构建好的B．orientalis cDNA文库进行免疫学筛选，筛选到3个强阳性克隆子。测序后BLAST分析分别为：B．orientalis热休克蛋白70（HSP70）基因，核动蛋白（nuclear movement protein）基因及功能未知的假定蛋白（hypothetical protein）基因。（4） B．orientalis EST序列的测定及分析从B．orientalis cDNA文库中随机挑取噬菌斑，转染BW25.8，经PCR鉴定后送插入片段大于300bp的阳性克隆子测序，共测定了324条B．orientalis EST序列，对有效EST序列运用phrap等软件进行拼接，聚类后BLAST分析，得到46个同源性较高的unigene，这些基因分别为：类红细胞表面抗原、类裂殖体表面抗原、代谢相关的磷酸酶及蛋白酶、核糖体蛋白、热休克蛋白70、类热休克蛋白90、肌动蛋白、锌指蛋白等基因的部分或全基因及功能未知的假定蛋白（hypothetical protein）基因部分或全基因。（5） B．orientalis HSP70基因的克隆与原核表达根据EST测序的结果，设计一对特异性扩增B．orientalis HSP70基因开放性读码框（ORF）的引物，克隆了B．orientalis HSP70的ORF全长基因，构建原核表达质粒pGEX-KG-HSP70，在E．coli BL21-CodonPlus中实现了高效表达，表达产物经Western-blot检测分析，结果表明原核表达的HSP70具有较强的免疫反应原性。本研究对B．orientalis的分子分类学研究，从分子水平证实了B．orientalis是一独立的新种。建立的半巢式PCR诊断方法，解决了目前水牛巴贝斯虫病不易准确诊断的难题，对水牛巴贝斯虫病的临床诊断、流行病学调查等具有重要意义。本研究构建的B．orientalis的cDNA文库、EST序列的测定以及HSP70基因的克隆和原核表达为进一步进行B．orientalis分子生物学的研究，获得免疫原性基因和其他基因信息以及水牛巴贝斯虫病的免疫预防、致病机制等研究奠定良好的基础。