大豆胁迫应答调控基因鉴定及功能解析

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大豆是植物蛋白质的主要来源,也是重要的油料和经济作物。其生长发育受到多种非生物胁迫的影响。植物具有多条途径应对环境胁迫,包括表观遗传调控。我们前期已从大豆中鉴定了一系列miRNA。本研究发现miR172a受高盐和干旱诱导,将pre-miR172a构建到表达载体pBin438上,通过发根农杆菌k599介导转化大豆,获得了拥有转基因毛状根的嵌合体植株。miR172a-OE嵌合体植株在80mM NaCl处理下,转基因毛状根的根长增长量显著高于对照,地上部鲜重和株高增长量也均显著高于对照。  本研究通过降解组测序,鉴定到miR172a切割的12个靶基因。进一步通过RLM-5RACE验证了其中6个靶基因的精确切割位点。其中靶基因GmSSAC1编码一个具有转录抑制活性的AP2家族的转录因子,GmSSAC1-RNAi嵌合体大豆毛状根在80mMNaCl处理下根长增长量、株高增长量和地上部鲜重均显著高于对照,其耐盐性状与miR172a-OE毛状根相似。而GmSSAC1-OE毛状根在80mM NaC1处理下根长增长量、株高增长量和地上部鲜重均显著低于对照,表现出了盐敏感的性状。通过转录组测序及qRT-PCR分析,鉴定到miR172a的下游基因GmTHI1,其为维生素B1合成的关键酶。在80mM NaCl处理下,GmTHI1-OE嵌合体大豆表现出了耐盐性状,而Gm THI1-RNAi嵌合体大豆表现出了盐敏感性状。AP2家族的转录因子GmSSAC1能够抑制下游基因GmTHI1的启动子活性。因此,miR172a可能通过切割GmSSAC1解除其蛋白对下游基因GmTHI1的抑制作用,从而增强大豆的耐盐性。此外,通过嫁接实验发现miR172a可以从转基因毛状根转运到地上部并调控靶基因及下游基因表达。NIMA(Never In Mitosis Gene A)激酶在细胞周期的调控中起重要作用,我们前期的工作发现拟南芥该类激酶(AtNEKs)中的AtNEK6参与逆境应答的调控。进一步从大豆基因组中鉴定了16个GmNEKs基因,通过同源性分析选择其中8个转化拟南芥进行功能分析。其中,GmNEK1转基因株系在盐和冷处理下的存活率均显著高于野生型,且植株叶片变大。通过转录组测序及qRT-PCR,鉴定了GmNEK1调控的下游基因,其中AtCORI3、AtALDH10A8和AtRH3在转基因拟南芥中有显著提高。GmNEK1可能通过调控这些下游基因来增强拟南芥的耐盐性和耐冷性。通过大豆毛状根转化技术,将GmNEK1基因在毛状根中进行过表达或通过RNAi技术抑制该基因表达以研究其在大豆中的功能。在盐处理情况下,GmNEK1-OE毛状根与对照相比表现出了耐盐性状,而GmNEK1-RNAi毛状根与对照相比则具有盐敏感表型。我们进一步通过大豆毛状根转化技术获得了GmNEK1下游基因GmRH3的过表达和RNAi嵌合体植株,其耐逆性表型与GmNEK1转基因嵌合体植株相似。80 mM NaCl处理下,GmRH3-OE嵌合体植株表现出耐盐性状,而GmRH3-RNAi嵌合体大豆对盐敏感。上述研究表明GmNEK1通过激活下游基因如GmRH3来促进植物生长提高耐逆性。
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