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骨质疏松症是主要表现为骨量减少、骨微结构破坏,导致骨骼强度和负荷承受能力降低,易于发生脆性骨折的一类全身性骨代谢障碍疾病,也是多种骨破坏性疾病共有的病理损害。骨质疏松发病率高,严重影响患者的生活质量,给社会带来沉重的经济负担。正常骨代谢主要依赖于破骨细胞发挥的骨吸收作用和成骨细胞发挥的成骨作用之间的平衡。任何原因导致这种平衡的破坏都会引起骨代谢性相关疾病。其中,破骨细胞活性和功能的增强在这一过程中发挥着极其重要的作用。核因子κB受体活化因子配体(RANKL,Receptor Activator of Nuclear Factor-κB Ligand)对破骨细胞的分化、成熟及功能都发挥着关键性作用。RANKL结合到破骨前体细胞的核因子κB活化因子受体(RANK)上,启动下游NF-κB,P38,ERK,JNK等信号通路,刺激破骨细胞的分化、成熟及功能。阻断RANKL与RANK的结合,可抑制破骨细胞的分化和成熟。抗RANKL单克隆抗体Denosumab可以特异性地阻断RANKL与其受体的结合,有效地的抑制破骨细胞的分化、成熟和功能,对骨质疏松等骨吸收性疾病疗效明显。最近研究表明,在自体蛋白中插入非天然氨基酸可以突破免疫耐受,使机体产生针对自体蛋白高滴度的抗体。本研究探讨非天然氨基酸突变的小鼠RANKL蛋白(p NO2Phe234m RANKL)的克隆、原核表达和纯化,以及用其作为抗原免疫小鼠,制备小鼠抗m RANKL的抗血清,并分析该抗血清的抗体滴度和活性,为进一步探究阻断RANKL-RANK通路的新方法奠定基础。【方法和结果】①首先通过RT-PCR克隆了具有活性的小鼠RANKL(m RANKL)的胞外段基因,将编码第234位酪氨酸的密码子(TGA)突变成能编码p-硝基苯丙氨酸的密码子,然后构建了p ET28a-p NO2Phe234m RANKL重组表达载体并经测序验证构建成功。②成功将p ET28a-p NO2Phe234m RANKL重组表达载体与p EVOL质粒共转化至E.coli BL21(DE3)原核表达菌中,用阿拉伯糖和IPTG诱导,成功表达并纯化了目的蛋白。经SDS-PAGE与Western Blot检测,该蛋白与预测蛋白大小一致;通过高效液相色谱联合质谱检测进一步证实成功插入了p-硝基苯丙氨酸。③以纯化蛋白作为免疫原,采用多位点皮下重复注射的方法免疫小鼠,采用Western Blot和间接ELISA分别检测抗血清活性和抗m RANKL抗体滴度。结果表明,成功制备了小鼠抗m RANKL的抗血清,该抗血清具有较高的活性,既能与p NO2Phe234m RANKL重组蛋白结合,又能与野生型m RANKL结合,效价为1:6400。【结论】通过本实验,我们首次克隆并表达了p-硝基苯丙氨酸突变的小鼠RANKL(m RANKL)的胞外段,通过高效液相色谱联合质谱检测验证了p-硝基苯丙氨酸的成功插入;并以此蛋白为抗原免疫小鼠,制备了小鼠抗m RANKL的抗血清,该抗血清效价为1:6400,具有较高的活性,既能与p NO2Phe234m RANKL重组蛋白结合,又能与野生型m RANKL结合,为后期深入探究阻断RANKL-RANK通路的新方法,进而实现骨质疏松的治疗打下了基础。