杆状病毒AcMNPV orf109基因功能研究

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杆状病毒是一类寄生于节肢动物的具有包膜包被的闭合双链DNA病毒,其病毒粒子呈杆状,宿主主要为鳞翅目昆虫幼虫。杆状病毒被广泛的应用为病毒杀虫剂和外源基因高效表达载体。杆状病毒科分为四个属:Alpha杆状病毒属、Beta杆状病毒属、Gamma杆状病毒属和Delta杆状病毒属。苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus,AcMNPV)在分类学上属于杆状病毒科Alpha杆状病毒属的GroupⅠ,并且是Alpha杆状病毒属的代表种,了解其中基因的功能对于其它杆状病毒基因功能的研究具有重要的指导意义。   在AcMNPV中预测的152个开放性阅读框(Open Reading Frames,ORFs)中,orf109是杆状病毒科中30个保守基因之一但其功能未知,其很可能为病毒复制的必需基因。对ac109基因序列进行生物信息学分析,其基因序列全长1173bp,有且仅有一个晚期或极晚期基因启动子保守元件GTAAG,预测其编码一个含有390个氨基酸、分子量为44.802KDa的蛋白质。通过预测蛋白保守结构域的InterProScan分析表明,ac109基因序列中存在一个属于未知功能病毒蛋白质家族DUF673的结构域。   此研究通过ET recombination系统构建了ac109基因缺失型AcMNPV重组病毒,并且通过Bac-to-Bac系统构建了带有绿色荧光蛋白基因(gfp)和多角体基因(polyhedrin)双标记的野生型(Ac-GP)、ac109基因缺失型(Ac-ac109-KO-GP)及ac109基因补回型(Ac-ac109-REP-GP)重组病毒。   研究中将三种重组病毒分别转染Sf9细胞并观察ac109的缺失对病毒在离体细胞中复制的影响。荧光显微镜观察结果表明缺失型重组病毒的扩散被限制于初次转染细胞,呈现出单细胞感染的现象。光镜显微镜未能在缺失型重组病毒转染的细胞中观察到多角体。病毒转染上清滴度测试结果表明在缺失型重组病毒曲线中未能观察到病毒的传播。实时荧光定量PCR结果表明ac109的缺失不影响病毒DNA的复制。电镜结果表明在缺失型重组病毒转染的细胞中虽然观察到典型的病毒感染症状但无正常组装的核衣壳出现。并且这些功能缺陷现象在ac109补回之后能恢复到野生型的状态。   研究结果证明了ac109基因是杆状病毒核衣壳的正常组装的过程中所必需的基因。
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