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肿瘤等疾病往往伴有多种体细胞突变,近年来,某些基因的突变情况已经作为癌症预后和治疗疗效预测的一种生物分子标记物,服务于分子靶向治疗。在化疗无效的结直肠癌患者中,针对EGFR的靶向治疗药物目前取得了重大进展。但大量研究表明,患者一旦携带有K-ras基因第2号外显子密码子12和13上的突变,就表现出对EGFR靶向治疗药物的耐药。因此,K-ras基因的突变与否可作为结直肠癌患者进行EGFR靶向治疗的有效预测因子。
体细胞突变往往存在大量的野生型背景,对检测技术的要求极高。本论文以探针熔解曲线分析为基本技术平台,结合不同的引物扩增技术和PCR策略建立并验证了三种针对K-ras常见七种突变类型的检测体系,三种体系所探讨的方法都有望用于其它体细胞突变的检测中。
在第一个体系中,我们将探针熔解曲线分析技术分别与不对称PCR和不对称快速COLD-PCR结合起来,并对两种扩增技术的检测能力进行了比较。结果表明,不对称快速COL-D-PCR对突变模板的富集能力约为普通体系的10倍。使用快速COLD-PCR后,对于Tm值降低的五种突变类型,体系的选择性从普通体系的5％提高到了0.5％。本体系简便快速,一管一次反应即可对七种常见突变进行准确筛查,缺点是无法确知样品的突变类型。
在第二个体系中,我们将探针熔解曲线分析技术与序列特异性引物的不对称PCR扩增结合起来,建立了针对K-ras常见七种突变的八管检测体系。此体系的优点是选择性可以达到0.01％-0.5％,可以区分样品的突变类型,缺点是管数较多,操作起来比较麻烦。
在第三个体系中,我们将探针熔解曲线分析技术与人工熔点标签标记的引物扩增技术结合起来,建立了针对K-ras常见七种突变的两管检测体系。人工熔点标签技术实现了一管多个突变的同时筛查与区分。优点是两管体系操作简便,选择性较高(0.5％),可以区分样品的突变类型。
三种体系检测结果的Kappa一致性检验表明,三种体系的一致性很好。
本论文所探讨的方法有望用于其它体细胞突变的检测中。