论文部分内容阅读
棘胸蛙(Paa spinosa David)，又名石蛙，是我国棘蛙属中分布最广的物种之一，目前主要分布于云南、贵州、安徽、江苏、浙江、江西、湖北、湖南、福建、广东、广西和香港等地。与其它两栖动物一样，由于栖息地破坏、野生资源过度利用以及全球气温变暖等造成的病菌蔓延，棘胸蛙的种群数量已经下降了30％左右。主要组织相容性复合体(MHC)是广泛存在于脊椎动物体内与免疫功能密切相关的高度多态基因群，MHCⅡ类抗原与许多动物疾病的抗病性、感病性密切相关。MHC作为一种内在因子，其变异模式被认为在两栖动物数量的下降中起了关键作用。棘蛙属是蛙科系统关系研究的重要类群，对研究两栖动物的系统发育和进化有重要的意义。同时，棘胸蛙是一种具有较高经济价值的物种，研究与其免疫力有关的MHC基因具有理论和实践的双重意义。
本研究以棘胸蛙为研究对象，使用PCR、RT-PCR、SMART-RACE等技术对MHCⅡB类基因进行克隆与多态性分析，并研究了MHCⅡB等位基因多态性与棘胸蛙抗病力之间的关系，为筛选MHCⅡB抗病相关基因分子标记，建立基因分子标记辅助遗传育种工作提供基础。主要结果如下:
(1)利用同源扩增和RACE-PCR技术获得了棘胸蛙1136bp的MHCⅡB基因全长cDNA序列，并对其序列特征和结构进行了分析，包括765bp的开放阅读框（ORF）、89bp的5末端非编码区(5-UTR)以及282bp的3末端非编码区(3-UTR)。通过与NCBI上已经发表的同源物种进行序列对比，确定测的基因序列是棘胸蛙MHCⅡB基因序列，其与非洲爪蟾的相似性达到72％。利用MEGA4.0软件对棘胸蛙MHCⅡB基因序列与其它已知的脊椎动物的MHCⅡB基因的序列进行比较和进化树分析。
(2)设计位于MHCⅡB基因两端的特异性引物，用高保真酶从五只野生棘胸蛙中扩增该基因的开放阅读框（ORF），挑取阳性克隆进行双向测序，结果得到11条非重复序列;每个个体最多有三种基因型，最少有一种基因型，说明棘胸蛙可能有两个DAB基因座位。得到的11条氨基酸序列分别命名为Pasa-DAB*0101-0601。在ORF氨基酸序列中，有59(24.18％)氨基酸位点发生变异其中43(17.62％)个位点出现在第二外显子。
(3)为了研究MHCⅡB等位基因与棘胸蛙抗病感染的相关性，用200只棘胸蛙进行嗜水气单胞菌感染实验，利用1对特异引物，分别对40只抗病棘胸蛙和40只感病棘胸蛙进行PCR扩增，得到包含大部分exon2的DNA片段。从388个阳性克隆的测序结果中，挑选得到26种不同的核苷酸序列，分别编码26种不同的氨基酸序列。分析其中的63个密码子，70(37.63％)核苷酸位点和37(59.68％)氨基酸位点发现变异。分析26条序列，有45个位置发生核苷酸替换。挑选出9个高频等位基因研究MHCⅡB类基因多态性与抗病性/易感性之间的关联，经卡方检验计算9种基因型在两个群体中的出现频率，其中大部分基因型在两个群体中同时存在;但是等位基因Pasa-DAB*1301和Pasa-DAB*3701在存活个体中出现的概率明显高于在死亡个体中出现的概率，它们可能与嗜水气单胞菌感染的抵抗性相关;尽管结果不明显，但等位基因Pasa-DAB*2801更多出现在感病个体中，说明其可能与嗜水气单胞菌感染的感病性相关。对核苷酸替换类型和位点进行分析，结果发生在抗原结合位点的非同义碱基替换(dN)与同义碱基替换率(dS)的比值远远大于非抗原结合位点的dN/dS，说明核苷酸替换主要发生在exon2的抗原结合位点(Protein binding region，PBR)上，且抗原结合位点受正向选择影响。