【摘 要】
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该文根据禽流感病毒(avian influenza virus,ATV)核蛋白(NP)基因核苷酸序列,设计合成了NP基因特异的引物NPF/R.不需要经过病毒分离,直接从禽流感病毒感染鸡的气管、泄殖腔棉
【出 处】
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中国农业科学研究院 中国农业科学院
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该文根据禽流感病毒(avian influenza virus,ATV)核蛋白(NP)基因核苷酸序列,设计合成了NP基因特异的引物NPF/R.不需要经过病毒分离,直接从禽流感病毒感染鸡的气管、泄殖腔棉拭子和组织榈中用Trizol试剂提取病毒核酸,采用RT-PCR技术可以扩增出326bp的NP基因片段.采用引物NPF/R14个亚型禽流感病毒标准参考株,4个亚型12株国内分离野毒株进行RT-PCR,都能特民的扩增出扩增326bp左右的目的片断,采用地高辛标记的NP基因探针进行斑点杂交,结果证明了PCR产物的特异性.根据Genbank数据库中发表的H5和H7亚型禽流感病毒血凝素基因(HA)核苷酸序列,分别设计合成了H5和H7亚型HA基因特异的引物H5F/R和H7F/R,建立了RT-PCR鉴别H5和H7亚型的分子分型诊断技术.分别设计了HA基因和NA基因特异的引物,引物5端分别添加有BamHⅠ位点和HindⅢ位点,经RT-PCR扩增了禽流感病毒A/Goose/Guandong/1/96 (H5N1) 1.7kb的HA基因和1.4kb的NA基因,HamHⅠ和HindⅢ酶切,然后克隆到pUC19的BamHⅠ位点和HindⅢ位点,酶切筛选得到阳性重组子pUCH5和pUCN1.在脂质体转染试剂Cee11FECTIN介导下,将杆状病毒转移载体pBacH5和pBacN1与线性化的杆状病毒DNA (Bac-N-Blue DNA)共转染对数生长期的SF9昆虫细胞,挑取蓝色蚀斑, 经三轮蚀斑纯化,获得重组杆状病毒rBacH5和rBacN1.重组樯状病毒rBacH5、rBacN1、rBacH7和野生病毒AcMNPV感染Sf9细胞72小时后收集细胞,免疫6组6周龄SPF鸡.上述试验结果初步表明重组杆状病毒表达的HA和NA蛋白对鸡具有良好的免疫原性,重组HA蛋白诱导的抗体可以保护实验鸡免受强毒的致死性攻击.总之,该研究为中国防制H5和H7亚型高致病性禽流感的暴发流行奠定了基础.
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