论文部分内容阅读
动脉粥样硬化是多种心血管疾病发生的基础，血管内皮细胞损伤所诱导的炎症反应已被认为是动脉粥样硬化发生的起始事件。动脉粥样硬化的发生发展涉及血管内皮细胞发生炎症反应，单核细胞粘附于损伤的内皮细胞并迁移至血管内膜，随后在血管内膜炎症微环境下分化成巨噬细胞，随后摄入氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)形成泡沫细胞。同时血管平滑肌细胞从中膜迁移至内膜，在血管内膜增生并合成大量纤维蛋白，泡沫细胞与纤维蛋白相互交联形成斑块，导致早期动脉粥样硬化斑块的形成。机械拉伸力是血液流变动力学之一，研究表明动脉粥样硬化容易发生在血管弯曲和分叉处，这些区域的机械拉伸力呈现分布不均匀且多向的特点。长期高血压能够导致血管内皮细胞承受高强度的机械拉伸力，由此导致内皮损伤和炎症反应发生。本研究利用本课题组自主设计的微流控拉伸装置，施加不同强度的机械拉伸力于血管内皮细胞，构建类似血管弯曲区域内皮细胞的拉伸环境，探究机械拉伸力对动脉粥样硬化起始阶段和泡沫细胞形成的影响。 研究内容和结果如下: 1.微流控拉伸芯片的制作和参数校准 使用聚二甲硅氧烷(PDMS)为制作材料，通过模塑法制作简易的微流控拉伸芯片，并通过显微观察等方法校正微流控拉伸芯片液体注射量以及测量15％拉伸强度的拉伸力分布情况。 2.构建非均一拉伸力诱导血管内皮细胞炎症反应体外模型 通过对内皮细胞EA.hy926施加不同强度非均一拉伸力，利用倒置显微镜观察、细胞荧光染色、qRT-PCR、Western blot等方法探讨非均一拉伸力对细胞形态、细胞凋亡、炎症因子表达等细胞行为的影响。结果显示，高强度(≥15％)非均一拉伸力促使EA.hy926细胞由梭形或多边形变为圆形形态，并伴随显著的细胞凋亡，同时显著地促进EA.hy926细胞内炎症相关因子IL-8、MCP-1、ICAM-1和Rel-A蛋白表达水平，20μM和40μM阿司匹林能有效抑制15％非均一拉伸力诱导的EA.hy926细胞凋亡。 3.非均一拉伸力诱导血管内皮细胞炎症反应和单核细胞极化 利用Calcein-AM荧光染色、Western blot和免疫荧光方法观察非均一拉伸力对内皮细胞粘附连接的影响;通过构建单核细胞THP-1和PUMC-HUVEC-T1细胞共培养体系，观察非均一拉伸力对THP-1粘附能力的影响，并利用qRT-PCR和ELISA测定共培养前后炎症因子的表达和分泌量变化;CFSE荧光染色、免疫荧光、ELISA、油红O染色方法分别观察非均一拉伸力对单核细胞THP-1的巨噬细胞样分化、极化现象以及对泡沫细胞形成。结果显示，15％非均一拉伸力损伤内皮细胞间粘附连接;与5％拉伸强度实验组比较，15％非均一拉伸力显著促进THP-1细胞粘附能力且具有时间依赖性，诱导TNF-α转录水平上升以及促进共培养环境中TNF-α浓度的增加，同时促进单核细胞发生巨噬细胞样分化，并主要极化为M2型巨噬细胞。然而对泡沫细胞的形成无显著影响。 4.ox-LDL协同非均一拉伸力促进动脉粥样硬化的发展和泡沫细胞形成 ox-LDL与动脉粥样硬化的发展紧密相关，利用免疫荧光、荧光染色、ELISA以及油红O染色技术探讨机械拉伸力协同ox-LDL对内皮细胞粘附连接、单核细胞分化与极化，以及泡沫细胞形成。研究结果显示，25μg/mL ox-LDL协同15％非均一拉伸力显著破坏内皮细胞粘附连接，诱导共培养体系中更多的THP-1细胞巨噬细胞样分化，促进GM-CSF浓度增加诱导M1型巨噬细胞形成，并导致泡沫细胞的形成。