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蛋白的加工处理过程对于生物体维持正常的生命过程具有非常重要的意义。而这一功能的实现主要依赖于生物体内大量的蛋白酶。作为模式生物的大肠杆菌，目前在其基因组中发现了75种蛋白酶基因。不同的蛋白酶具有不同的活性，识别不同的底物。以前的研究发现，在细菌染色体复制之前能够检测到一个短暂出现的类胰蛋白酶活性峰。一种人工合成的胰蛋白酶抑制剂GMCHA—OPhtBu也能够对多种大肠杆菌和枯草杆菌等产生强烈的抑制作用。此外，在人类的多种病原体(如克氏锥虫、齿密螺旋体等)感染宿主过程中，同样检测到一种类胰蛋白酶的活性。所以，对于这种类胰蛋白酶的研究，将有助于新型抗生素的开发和许多病原体感染的检测与治疗。研究发现，大肠杆菌中有两种蛋白酶具有类胰蛋白酶的活性，即Oligopeptidse A(OpdA)和Oligopeptidse B(OpdB)。虽然这两种蛋白酶的发现较早，但其在细胞内的生理功能还知之甚少。为了能够在这方面有所突破，我们尝试寻找了这两种蛋白酶在细胞中的相互作用蛋白，同时研究了它们的一些其他相关特性。本文包括五部分的内容：
一、利用细菌双杂交系统，筛选大肠杆菌DH5α基因组文库，发现了五个插入片段可与opdA相互作用。这些片段的Blast分析结果显示其分别属于yieM，atoE，glpG，ybjE和ybjW五个基因。
二、利用pET28a系统表达并纯化大肠杆菌OpdB蛋白。发现该蛋白和OpdA蛋白对于合成的胰蛋白酶底物的特异性不同，Boc—Glu—Lys—Lys—MCA可作为OpdB的特征性底物。该蛋白对于胰蛋白酶抑制剂GMCHA—OphtBu的敏感性比OpdA更高。发现该蛋白酶的过量表达对不同生长期的细菌具有不同的影响。同时，过量表达该蛋白酶的细菌表现出对于生长抑制剂GMCHA—OphtBu敏感性的降低。
三、天冬氨酸激酶(AK)是大肠杆菌苏氨酸合成途径中的关键酶，有研究表明OpdB很可能降解AKⅢ，为了更深入的研究这一现象。我们采用两种方法表达纯化了的E.coli AKⅢ。初步研究了AKⅢ在体外与大肠杆菌类胰蛋白酶(OpdA和OpdB)的相互作用。发现纯化的OpdB对纯化的AKⅢ在Buffer A的缓冲液中没有明显的切割作用。然而纯化的AKⅢ与OpdA或OpdB的超声上清温浴后发现有一定的降解作用发生。
四、大肠杆菌SeqA蛋白是一种DNA复制起始的负调控因子，文献报导SeqA具有两个结构域并且在体外可被胰蛋白酶(trypsin)切割。为了研究其与类胰蛋白酶的关系，我们进行了体内和体外的相互作用研究，结果证明SeqA不能被OpdA或OpdB所切割，同时在体内他们也不能相互作用。证明SeqA的胰蛋白酶切割现象很可能只是一种体外的情况。
五、单杂交技术是分析DNA与蛋白质相互作用的一种方法。常用的为酵母单杂交系统，但鉴于该系统的操作复杂、实验周期长和在研究真核生物蛋白时，由酵母内源蛋白所引起的假阳性和假阴性较多等现象，我们设计并构建了一种新型的细菌单杂交系统。该系统使用细菌作为宿主菌；Plac作为Pmin；Cmr为报告基因；RNAα为转录激活域。