论文部分内容阅读
目的：通过构建不同剂量砷中毒细胞模型，利用染色质免疫共沉淀技术（Chromatin immunoprecipitation assay，ChIP）和实时荧光定量PCR技术，对MGMT基因高甲基化启动子区甲基化 DNA结合蛋白2（MeCP2）、DNA甲基转移酶1（DNMT1）及组蛋白去乙酰化酶1（HDAC1）结合情况进行检测。从染色质重塑的角度探讨砷致MGMT基因转录抑制的分子机制。 方法：分别以25.00μmol/L、12.50μmol/L、6.25μmol/L、3.13μmol/L NaAsO2重复间隔处理HaCaT细胞72h（NaAsO2处理24h，隔天再次用NaAsO2进行相同的处理，重复处理3次）。设不染毒的HaCaT细胞为空白对照，用不含血清的培养液进行上述相同处理，人表皮鳞癌细胞株（A431）为阳性对照；定量染色质免疫共沉淀技术（Q-ChIP）检测 MGMT基因转录调控区（表示为 ChIP1、ChIP2区域）及MGMT基因编码区（表示为 ChIP3区域，对照区域）MeCP2、DNMT1、HDAC1蛋白结合情况。 结果：1、高甲基化MGMT基因转录调控区ChIP1区域：MeCP2蛋白结合水平分别为134.50±43.13、141.50±23.33、130.00±42.43、136.00±16.97、51.50±9.19，染毒组高于空白对照组，差异有统计学意义（F=7.387，P＜0.05），各染毒组之间两两比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；DNMT1蛋白结合水平分别为472.50±50.20、161.50±7.78、154.50±4.95、145.00±2.83、82.00±12.73，染毒组高于空白对照组，差异有统计学意义（F=84.634，P＜0.05），各染毒组之间两两比较发现，25.00μmol/L NaAsO2处理组高于其他剂量组，差异有统计学意义（P＜0.05）；HDAC1蛋白结合水平分别为383.50±30.41、125.00±11.31、101.00±1.27、88.50±19.09、25.03±2.91，染毒组高于空白对照组，差异有统计学意义（F=78.442，P＜0.05），各染毒组之间两两比较发现，25.00μmol/L NaAsO2处理组高于其他剂量组，差异有统计学意义（P＜0.05）。 2、高甲基化MGMT基因转录调控区ChIP2区域：MeCP2蛋白结合水平分别为180.09±12.73、119.50±24.75、88.50±3.54、106.50±37.48、37.02±4.24，染毒组高于空白对照组，差异有统计学意义（F=19.263，P＜0.05），各染毒组之间两两比较发现，25.00μmol/L NaAsO2处理组高于其他剂量组，差异有统计学意义（P＜0.05）；DNMT1蛋白结合水平分别为348.50±27.58、171.59±3.54、134.32±2.82、112.34±8.73、91.56±26.16，染毒组高于空白对照组，差异有统计学意义（F=69.649，P＜0.05），各染毒组之间两两比较发现，25.00μmol/L NaAsO2处理组高于其他剂量组，差异有统计学意义（P＜0.05）；HDAC1蛋白结合水平分别为158.45±12.02、167.61±10.61、102.75±19.91、59.71±8.49、19.09±2.90，染毒组高于空白对照组，差异有统计学意义（F=26.546，P＜0.05），各染毒组之间两两比较发现，25.00μmol/L NaAsO2处理组高于其他剂量组，差异有统计学意义（P＜0.05）。 3、MGMT基因编码区ChIP3区域：MeCP2蛋白结合水平分别为213.51±79.90、102.06±35.36、100.2±11.60、127.32±3.54、160.21±2.83，染毒组与空白对照组比较，差异无统计学意义（F=1.670，P＞0.05）；DNMT1蛋白结合水平分别为615.85±29.63、120.65±42.43、159.35±16.26、219.50±57.28、99.70±12.02，染毒组与空白对照组比较，差异有统计学意义（F=4.404，P＜0.05），进一步比较发现只有25.00μmol/L NaAsO2染毒组高于空白对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；HDAC1蛋白结合水平分别为306.09±59.40、159.21±12.73、118.10±19.80、70.50±34.65、92.45±48.79，染毒组与空白对照组比较，差异有统计学意义（F=9.863，P＜0.05），进一步比较发现只有25.00μmol/L NaAsO2染毒组高于空白对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。 结论： 1、MeCP2结合于砷所致高甲基化MGMT基因转录调控区，并通过招募HDAC1导致组蛋白去乙酰化。与此同时，MeCP2又通过招募DNMT1来巩固其结合的稳定性，而后者又可招募HDAC1，从而使组蛋白进一步去乙酰化，导致染色质紧缩。 2、高砷暴露时，DNMT1可结合于MGMT基因编码区，以非甲基化CpG结合蛋白依赖的方式结合并招募HDAC1，引起组蛋白去乙酰化，参与染色质重塑过程。 3、砷通过染色质重塑方式介导 MGMT基因沉默，从而干扰正常的DNA损伤修复过程，进而成为促癌因素，可能是砷毒性表现的早期分子事件之一。