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目的：探讨应用活体染料羧基荧光素乙酰乙酸[CFDA-SE]分别标记乳兔视网膜色素上皮(RPE)细胞和成兔虹膜色素上皮(IPE)细胞的可行性,观察标记的供体细胞在体内移植后的分布、移行和与受体RPE细胞的整合及屏障重建情况,同时探索一种简单高效的细胞视网膜下的移植新方法。
方法：选择合适浓度、温度和时间,应用活体染料CFDA-SE标记传代后的乳兔RPE细胞、成兔IPE皮细,对照绿色荧光蛋白(GFP)转染乳兔RPE细胞,通过流式细胞仪分析和荧光显微镜下荧光亮度的观察,比较其各自的成功率。应用我们首创的单通道视网膜下注射方法,将标记的异体乳兔RPE细胞和自体成兔IPE细胞悬液分别移植到受体成兔神经视网膜下；术后采用激光扫描检眼镜(cSLO)、光学相干断层扫描(OCT)、眼底荧光血管造影(FFA)、吲哚氰绿血管造影(ICGA)、彩色眼底照相等活体影像学技术手段,并结合免疫组织化学、免疫细胞化学及光、电镜技术来追踪观察标记的供体色素上皮细胞移植到受体后的一系列变化情况。
结果：CFDA-SE成功地标记乳兔RPE细胞和成兔IPE细胞,20μmol/LCFDA-SE 37℃孵育1分钟为最适标记条件,体外染色可至少持续4周以上,没有影响细胞的性状及抗原的表达：流式细胞仪检查结果显示CFDA-SE细胞染色标记率比GFP细胞转染率有显著性增高。移植到受体视网膜下的CFSE标记的异体乳兔RPE细胞或自体成兔IPE细胞生长良好,供体细胞可在体内追踪到绿色荧光至少6个月,细胞移植术后观察显示移植区界限清晰:cSLO可观察到移植区内荧光分布、FFA检查受体眼血.视网膜屏障(BRB)未破坏；OCT活体组织检查和视网膜组织切片HE染色检查均显示移植区神经上皮层下早期有移植物堆积,并随时间推移逐渐变平,2月后标记的供体细胞整合进入受体原RPE单层。而且各项检查没有发现BRB屏障的渗漏和不完整。同时免疫荧光组化显示移植区ZO-1、Actin呈阳性,有规律地分布在Bruch膜上,供体RPE细胞或IPE细胞嵌插在受体原RPE细胞间,且形成完整的单层。透射电镜结果可见色素上皮细胞间紧密连接存在。在移植术后长达6个月的时间内,活体检查显示移植物保持正常生长,免疫细胞化学和组织化学检查也没有发现免疫排斥的迹象。这可能与我们移植手术副损伤较小,对免疫赦免区未造成破坏有关。
结论：CFDA-SE作为活体染料标记视网膜色素上皮细胞或虹膜色素上皮细胞进行移植时,是一种快捷、稳定、安全的活体细胞染料,可作为理想的标记物应用。我们探索的视网膜下色素上皮细胞移植方法操作简单、安全、成功率高,可以进一步在其他动物活体实验来完善和改进,以有助于临床相关研究的进展。