论文部分内容阅读
小窝蛋白(caveolin)是分子量为21—24kDa的膜整合蛋白，是小窝的主要结构成分。该基因家族含有三个成员(CAV1、CAV2&CAV3)。在人和小鼠的研究中发现，小窝蛋白对细胞胆固醇稳态的维持和脂肪酸代谢具有重要作用，本课题组在前期研究中也发现猪CAV1基因的表达对脂滴形成效率至关重要，与猪的脂肪沉积能力有紧密联系。
目前，国内外对猪的小窝蛋白基因家族研究报道很少，为了进一步研究猪CAV1、CAV2和CAV3基因的功能，本研究对CAV1、CAV2和CAV3三个基因在蓝塘猪13个组织中的表达量进行了初步检测和分析，验证了小窝蛋白对脂滴形成和代谢可能具有重要作用，研究还对CAV3进行了亚细胞定位分析。另外，利用慢病毒载体首次成功构建了CAV1、CAV2过表达和CAV1干扰载体。本研究主要结果如下：
1、采用实时定量PCR的方法对CAV1、CAV2和CAV3三个基因在蓝塘猪13个不同组织中的表达量进行了检测。结果发现：CAV1、CAV2在各组织中的表达趋于一致，在背膘中的表达量最高，而CAV3则在肌肉组织中表达量最高。
2、亚细胞定位试验结果表明猪CAV3基因的表达产物主要分布在内质网，在细胞核和线粒体中，没有发现CAV3基因的表达产物。
3、利用Gateway技术分别将猪CAV1和CAV2基因的编码区构建到慢病毒载体中，并进行了病毒包装和滴度的测定，筛选出杀稻瘟菌素对293FT细胞和PK15细胞株的最小致死浓度为0.3μg/mL和0.4μg/mL，慢病毒超速离心浓缩后应用该浓度测得病毒颗粒滴度为104TU/mL。
4、将含有CAV1、CAV2基因的编码区序列的慢病毒分别成功感染PK15细胞后，筛选出能够稳定表达CAV1和CAV2基因的PK15细胞株。实时定量PCR检测结果表明，在过表达CAV1和CAV2基因的PK15稳定株中，CAV1和CAV2基因的表达量均得到显著提高。
5、筛选出CAV1基因3个有效的RNA干扰片段，并成功将其中一个构建到慢病毒载体中，进行了病毒包装和滴度测定。