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研究背景:子宫腺肌病可导致育龄期女性出现不孕、痛经、慢性盆腔痛、性交痛、异常子宫出血等症状，并且随月经周期进行性加重且目前尚无根治性方法。子宫肌层存在内膜腺体和间质以及子宫肌细胞肥大是本病的主要特征，异位内膜的高侵袭迁移能力值得关注。在各类恶性肿瘤的研究中发现，上皮-间质转化(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)现象的存在导致癌细胞恶性进展，在包括肝癌、肾癌、皮肤鳞状细胞癌等多种癌症中检测到干扰素/维甲酸联合应用诱导细胞凋亡相关基因-19(gene associated with retinoid-interferon-induced mortality-19，GRIM-19)低表达，GRIM-19的低表达和肿瘤EMT有关。GRIM-19的低表达同样发生于子宫腺肌病异位病灶中，而GRIM-19差异表达参与子宫腺肌病发生发展的机制研究有待深入。
研究目的:探索GRIM-19低表达参与子宫腺肌病发生发展的机制及GRIM-19在子宫腺肌病中对EMT的影响。
研究方法:
1.GEO数据库子宫腺肌病差异基因分析及生物学功能分析。
2.临床样本:Westernblotting和qRT-PCR检测子宫腺肌病患者异位内膜和正常对照组子宫内膜中GRIM-19、威尔姆氏瘤基因-1(Wilms tumor-1，WT1)、Snail和EMT标志物表达。免疫组织化学染色检测子宫腺肌病患者异位内膜WT1表达。
3.细胞实验:(1)GRIM-19特异性siRNA转染Ishikawa细胞中，使用细胞活性检测试验(Cell Counting Kit-8，CCK-8)、划痕实验和Transwell等实验，检测细胞增殖、迁移和侵袭能力的变化。(2)Westernblotting和qRT-PCR检测GRIM-19低表达的细胞中WT1、Snail和EMT标记物的表达变化。
4.动物实验:通过Westernblotting和qRT-PCR检测GRIM-19基因敲除小鼠子宫WT1、Snail和EMT标记物表达变化。免疫组织化学染色检测GRIM-19基因敲除小鼠子宫WT1表达。
结果:
1.临床样本:
(1)子宫腺肌病异位内膜GRIM-19在蛋白质水平和mRNA水平较对照组正常子宫内膜表达下调(P=0.0057和P＜0.0001)。
(2)子宫腺肌病异位内膜WT1蛋白表达下调(P=0.0043)，WT1mRNA表达下降(P=0.0006)。免疫组织化学染色结果显示在子宫腺肌病异位内膜的腺上皮细胞中WT1染色水平提高(P=0.0045)，而在子宫腺肌病异位内膜的间质细胞和整体子宫腺肌病病灶中，WT1表达较对照组降低(P=0.0009和P=0.0024)。
(3)与正常子宫内膜相比，在子宫腺肌病异位内膜中，间质标记CDH2mRNA的表达增加(P=0.0183)，上皮标记KRT8的mRNA水平降低(P=0.0044)，上皮标记E-钙粘蛋白的蛋白表达在子宫腺肌病异位病灶中表达降低(P＜0.0001)。
2.细胞实验:
(1)CCK-8分析表明，GRIM-19表达下调后Ishikawa细胞的增殖能力增加(P=0.0449)。划痕实验结果表明，GRIM-19表达下调的Ishikawa细胞迁移能力高于对照组(P=0.0025)。Transwell实验结果表明，GRIM-19表达下调提高了Ishikawa细胞的迁移能力(P=0.0257)和侵袭能力(P=0.0368)。
(2)与对照组相比，GRIM-19的表达下调后，Ishikawa细胞中WT1mRNA表达上调(P=0.0306)，WT1蛋白质表达升高(P=0.0258);同时KRT8mRNA的表达降低(P=0.0108);Snail1的mRNA表达下降(P=0.0009)，而SNAIL+SLUG蛋白表达变化无统计学意义;随着GRIM-19的表达下调，KRT8蛋白表达下降(P=0.0174)，E-钙粘蛋白低表达(P=0.0482)，N-钙粘蛋白表达增加(P=0.0325)。
3.动物实验:
(1)GRIM-19+/-基因敲除小鼠可孕可育且无明显的表型异常，通过qRT-PCR和Westernblotting证实了GRIM-19+/-小鼠GRIM-19在mRNA(P=0.0058)和蛋白质(P=0.0153)水平低表达。
(2)WT1mRNA在GRIM-19+/-小鼠子宫高表达(P=0.0247)。Westernblotting结果显示WT1蛋白在GRIM-19+/-小鼠子宫表达增加(P=0.0128)。免疫组织化学染色结果同样表明GRIM-19+/-小鼠子宫WT1蛋白表达增高(P=0.0002)。
(3)GRIM-19+/-小鼠子宫上皮标志物E-钙粘蛋白在mRNA水平(P=0.0133)及蛋白质水平(P=0.0352)表达均下降，KRT8mRNA表达下调(P=0.0142)。
结论:
1.子宫腺肌病中GRIM-19和WT1的差异表达及EMT的发生可能和疾病发生发展有关。
2.子宫内膜细胞GRIM-19低表达促进WT1的表达和EMT的发生参与子宫腺肌病发生发展。
研究目的:探索GRIM-19低表达参与子宫腺肌病发生发展的机制及GRIM-19在子宫腺肌病中对EMT的影响。
研究方法:
1.GEO数据库子宫腺肌病差异基因分析及生物学功能分析。
2.临床样本:Westernblotting和qRT-PCR检测子宫腺肌病患者异位内膜和正常对照组子宫内膜中GRIM-19、威尔姆氏瘤基因-1(Wilms tumor-1，WT1)、Snail和EMT标志物表达。免疫组织化学染色检测子宫腺肌病患者异位内膜WT1表达。
3.细胞实验:(1)GRIM-19特异性siRNA转染Ishikawa细胞中，使用细胞活性检测试验(Cell Counting Kit-8，CCK-8)、划痕实验和Transwell等实验，检测细胞增殖、迁移和侵袭能力的变化。(2)Westernblotting和qRT-PCR检测GRIM-19低表达的细胞中WT1、Snail和EMT标记物的表达变化。
4.动物实验:通过Westernblotting和qRT-PCR检测GRIM-19基因敲除小鼠子宫WT1、Snail和EMT标记物表达变化。免疫组织化学染色检测GRIM-19基因敲除小鼠子宫WT1表达。
结果:
1.临床样本:
(1)子宫腺肌病异位内膜GRIM-19在蛋白质水平和mRNA水平较对照组正常子宫内膜表达下调(P=0.0057和P＜0.0001)。
(2)子宫腺肌病异位内膜WT1蛋白表达下调(P=0.0043)，WT1mRNA表达下降(P=0.0006)。免疫组织化学染色结果显示在子宫腺肌病异位内膜的腺上皮细胞中WT1染色水平提高(P=0.0045)，而在子宫腺肌病异位内膜的间质细胞和整体子宫腺肌病病灶中，WT1表达较对照组降低(P=0.0009和P=0.0024)。
(3)与正常子宫内膜相比，在子宫腺肌病异位内膜中，间质标记CDH2mRNA的表达增加(P=0.0183)，上皮标记KRT8的mRNA水平降低(P=0.0044)，上皮标记E-钙粘蛋白的蛋白表达在子宫腺肌病异位病灶中表达降低(P＜0.0001)。
2.细胞实验:
(1)CCK-8分析表明，GRIM-19表达下调后Ishikawa细胞的增殖能力增加(P=0.0449)。划痕实验结果表明，GRIM-19表达下调的Ishikawa细胞迁移能力高于对照组(P=0.0025)。Transwell实验结果表明，GRIM-19表达下调提高了Ishikawa细胞的迁移能力(P=0.0257)和侵袭能力(P=0.0368)。
(2)与对照组相比，GRIM-19的表达下调后，Ishikawa细胞中WT1mRNA表达上调(P=0.0306)，WT1蛋白质表达升高(P=0.0258);同时KRT8mRNA的表达降低(P=0.0108);Snail1的mRNA表达下降(P=0.0009)，而SNAIL+SLUG蛋白表达变化无统计学意义;随着GRIM-19的表达下调，KRT8蛋白表达下降(P=0.0174)，E-钙粘蛋白低表达(P=0.0482)，N-钙粘蛋白表达增加(P=0.0325)。
3.动物实验:
(1)GRIM-19+/-基因敲除小鼠可孕可育且无明显的表型异常，通过qRT-PCR和Westernblotting证实了GRIM-19+/-小鼠GRIM-19在mRNA(P=0.0058)和蛋白质(P=0.0153)水平低表达。
(2)WT1mRNA在GRIM-19+/-小鼠子宫高表达(P=0.0247)。Westernblotting结果显示WT1蛋白在GRIM-19+/-小鼠子宫表达增加(P=0.0128)。免疫组织化学染色结果同样表明GRIM-19+/-小鼠子宫WT1蛋白表达增高(P=0.0002)。
(3)GRIM-19+/-小鼠子宫上皮标志物E-钙粘蛋白在mRNA水平(P=0.0133)及蛋白质水平(P=0.0352)表达均下降，KRT8mRNA表达下调(P=0.0142)。
结论:
1.子宫腺肌病中GRIM-19和WT1的差异表达及EMT的发生可能和疾病发生发展有关。
2.子宫内膜细胞GRIM-19低表达促进WT1的表达和EMT的发生参与子宫腺肌病发生发展。