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背景与目的
卵巢癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤之一，致死率位居妇科恶性肿瘤首位，已成为威胁女性生命健康的主要肿瘤。浆液性卵巢癌约占所有上皮性卵巢癌的70％，其中90％以上是高级别浆液性卵巢癌，为恶性程度最高的亚型。目前临床治疗策略是以手术治疗为主，辅以化疗等辅助治疗方法，但晚期转移扩散、预后不良、化疗耐药等问题仍然对患者的生存构成威胁。因此，对于浆液性卵巢癌发生发展相关机制的研究，有助于为疾病检测和药物精准治疗提供可能的理论依据。
长链非编码RNA(Long-non coding RNA，LncRNA)是一类长度大于200nt核苷酸的RNA分子，无法编码蛋白质，在多种肿瘤的发生发展中起到重要作用。HAS2-AS1是透明质酸合成酶2反义RNA1(Hyaluronan Synthase 2 Antisense RNA 1)，是一种与肿瘤相关的LncRNA，与肿瘤细胞的异常增殖、上皮间质转化、侵袭转移、化疗耐药等恶性生物学行为密切相关，在多种肿瘤中发挥癌基因的角色。本研究旨在探讨HAS2-AS1在浆液性卵巢癌发生发展中的生物学作用及其作为竞争性内源RNA可能存在的作用机制，为浆液性卵巢癌的临床诊治提供潜在的方向。
材料与方法
1.验证浆液性卵巢癌组织中HAS2-AS1的表达
收集高级别浆液性卵巢癌(HGSOC)和正常输卵管组织(FT)临床组织标本，利用实时定量qRT-PCR技术，对FT和HGSOC组织进行检测，分析比较两组标本中HAS2-AS1的表达差异。
2.探究浆液性卵巢癌中HAS2-AS1的生物学功能
选取A2780、UWB1.289卵巢癌细胞，构建HAS2-AS1过表达和低表达的细胞系。通过细胞功能实验明确HAS2-AS1对卵巢癌细胞生物学功能的影响:MTT实验、平板克隆实验验证HAS2-AS1在卵巢癌细胞生长增殖中的作用;Transwell实验检测HAS2-AS1对卵巢癌细胞侵袭和迁移能力的影响;利用WesternBlot验证HAS2-AS1对EMT过程标志性蛋白表达的影响。
3.探究HAS2-AS1对卵巢癌细胞顺铂耐药性的影响
通过qRT-PCR检测A2780和耐药株A2780/DDP细胞中HAS2-AS1表达水平;对卵巢癌细胞进行顺铂梯度浓度药物刺激，通过MTT和耐药平板克隆实验分析HAS2-AS1表达对卵巢癌细胞顺铂敏感性的影响。
4.验证HAS2-AS1与miR-186-5p相互作用关系
通过生物信息学分析预测HAS2-AS1下游miRNA分子，发现miR-186-5p是HAS2-AS1潜在靶点。双荧光素酶报告基因实验验证miR-186-5p与HAS2-AS1相互作用关系，qRT-PCR技术检测抑制HAS2-AS1后miR-186-5p表达水平变化。验证miR-186-5p在HGSOC组织和FT组织中的表达差异，Person相关性分析验证HAS2-AS1与miR-186-5p在肿瘤组织中表达的相关性。
5.探究浆液性卵巢癌中miR-186-5p的生物学功能
在卵巢癌细胞A2780和UWB1.289中转染miR-186-5pmimics与对照组nc，qRT-PCR验证过表达效率，通过MTT实验验证miR-186-5p在卵巢癌细胞生长增殖中的作用;Transwell实验检测miR-186-5p对卵巢癌细胞的侵袭和转移的影响;利用WB验证miR-186-5p对EMT过程标志性蛋白表达的影响;顺铂梯度浓度加药，MTT验证miR-186-5p对细胞顺铂耐药性的影响。
6.验证miR-186-5p下游靶基因Twist1
通过生物信息学分析预测发现miR-186-5p与Twist13UTR区具有结合位点，通过双荧光素酶报告实验验证miR-186-5p与Twist1之间的相互作用关系，qRT-PCR和WesternBlot实验分别检测过表达和抑制HAS2-AS1、miR-186-5p后，Twist1在mRNA和蛋白水平的表达变化。
7.Rescue拯救实验验证HAS2-AS1/miR-186-5p/Twist1调控轴
在A2780和UWB1.289中分别转染shNC，shHAS2-AS1，shHAS2-AS1和miR-186-5pinhibitor，构建三组细胞系。通过qRT-PCR技术检测RNA水平上miR-186-5p和Twist1在三组细胞中的表达情况;WesternBlot实验检测对Twist1蛋白表达的影响。通过MTT，平板克隆实验，Transwell实验，顺铂梯度浓度加药等实验检测对卵巢癌细胞增殖、侵袭转移能力和耐药性的影响，完成对HAS2-AS1/miR-186-5p/Twist1轴调控卵巢癌生物学功能机制的探索。
研究结果
1.在高级别浆液性卵巢癌组织标本中，HAS2-AS1的表达水平(p＜0.001)高于正常输卵管组织。HAS2-AS1表达升高与浆液性卵巢癌患者的临床总生存时间相关(p=0.011)。
2.细胞功能实验结果显示:相比于正常对照组(Negtive Control，NC)，A2780和UWB1.289细胞中，MTT检测发现HAS2-AS1能够促进卵巢癌的异常生长，平板克隆实验显示过表达HAS2-AS1后细胞克隆形成能力明显增强;Transwell实验结果显示HAS2-AS1过表达后，A2780和UWB1.289卵巢癌细胞向小室下方移动的细胞数目明显增多，细胞的侵袭和迁移能力显著增强，抑制HAS2-AS1后细胞结果相反;EMT过程标志性分子(E-Cad、N-Cad、ZEB1、Vimentin)发生变化，抑制HAS2-AS1表达后，上皮标志物E-Cad蛋白表达上调，间质标志物N-Cad、ZEB1、Vimentin等蛋白表达降低，过表达HAS2-AS1后结果相反。
3.耐药相关性实验结果显示，与A2780细胞相比，HAS2-AS1在A2780/DDP耐药细胞中存在明显的表达升高。顺铂梯度浓度加药结果显示，抑制HAS2-AS1的表达使细胞在顺铂培养环境中存活率降低，细胞对顺铂的敏感性增加。过表达HAS2-AS1后细胞活性上升，对顺铂的耐药性增加。
4.生物信息学分析结果显示，HAS2-AS1与miR-186-5p存在互补结合位点。双荧光素酶报告实验显示，过表达miR-186-5p能使野生型质粒的荧光强度减弱，突变结合位点后，突变型质粒的荧光强度变化不明显，说明miR-186-5p与HAS2-AS1之间存在相互作用。qRT-PCR检测结果表明，抑制HAS2-AS1的表达能够使miR-186-5p表达水平升高，HAS2-AS1可以负性调控miR-186-5p的表达。高级别浆液性卵巢癌组织标本中miR-186-5p表达异常降低(p=0.0176)，Person相关性检验结果显示肿瘤组织中HAS2-AS1与miR-186-5p表达呈负相关。
5.miR-186-5p细胞功能实验结果表明，过表达miR-186-5p能够抑制细胞的增殖、侵袭转移能力，并且使细胞顺铂敏感性增加。
6.生物信息学分析发现miR-186-5p种子序列与Twist1mRNA的3UTR区有结合位点。双荧光素酶报告实验表明，转染野生型Twist1序列后，miR-186-5pmimics组能够显著抑制荧光素酶的活性，而突变型质粒的荧光强度变化值没有差别，表明miR-186-5p能够与Twist1在预测位点结合。沉默HAS2-AS1表达或过表达miR-186-5p后能够显著抑制Twist1mRNA和蛋白表达水平;过表达HAS2-AS1或抑制miR-186-5p后Twist1表达水平随之升高，表明HAS2-AS1与Twist1之间存在正向相关性，miR-186-5p负性调控Twist1的表达。
7.Rescue拯救实验结果显示，共转染shHAS2-AS1和miR-186-5pinhibitor会部分逆转HAS2-AS1沉默所引起的卵巢癌细胞增殖和侵袭迁移能力的抑制，使细胞对顺铂敏感性降低，耐药性增加。qRT-PCR和WesternBlot结果显示，抑制HAS2-AS1的表达可以使Twist1在mRNA和蛋白水平表达降低，并且这种抑制作用受到miR-186-5p的负性调控。说明HAS2-AS1能通过竞争性结合miR-186-5p调控Twist1的表达，促进浆液性卵巢癌的发生发展。
研究结论
1、HAS2-AS1在浆液性卵巢癌中普遍表达升高，与患者不良预后相关。
2、HAS2-AS1促进卵巢癌的异常增殖和侵袭转移，引起卵巢癌顺铂耐药。靶向阻遏HAS2-AS1的表达，可负性调控卵巢癌的恶性生物学行为。
3、HAS2-AS1通过竞争性结合miR-186-5p调控Twist1的表达，促进浆液性卵巢癌的发生发展。
卵巢癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤之一，致死率位居妇科恶性肿瘤首位，已成为威胁女性生命健康的主要肿瘤。浆液性卵巢癌约占所有上皮性卵巢癌的70％，其中90％以上是高级别浆液性卵巢癌，为恶性程度最高的亚型。目前临床治疗策略是以手术治疗为主，辅以化疗等辅助治疗方法，但晚期转移扩散、预后不良、化疗耐药等问题仍然对患者的生存构成威胁。因此，对于浆液性卵巢癌发生发展相关机制的研究，有助于为疾病检测和药物精准治疗提供可能的理论依据。
长链非编码RNA(Long-non coding RNA，LncRNA)是一类长度大于200nt核苷酸的RNA分子，无法编码蛋白质，在多种肿瘤的发生发展中起到重要作用。HAS2-AS1是透明质酸合成酶2反义RNA1(Hyaluronan Synthase 2 Antisense RNA 1)，是一种与肿瘤相关的LncRNA，与肿瘤细胞的异常增殖、上皮间质转化、侵袭转移、化疗耐药等恶性生物学行为密切相关，在多种肿瘤中发挥癌基因的角色。本研究旨在探讨HAS2-AS1在浆液性卵巢癌发生发展中的生物学作用及其作为竞争性内源RNA可能存在的作用机制，为浆液性卵巢癌的临床诊治提供潜在的方向。
材料与方法
1.验证浆液性卵巢癌组织中HAS2-AS1的表达
收集高级别浆液性卵巢癌(HGSOC)和正常输卵管组织(FT)临床组织标本，利用实时定量qRT-PCR技术，对FT和HGSOC组织进行检测，分析比较两组标本中HAS2-AS1的表达差异。
2.探究浆液性卵巢癌中HAS2-AS1的生物学功能
选取A2780、UWB1.289卵巢癌细胞，构建HAS2-AS1过表达和低表达的细胞系。通过细胞功能实验明确HAS2-AS1对卵巢癌细胞生物学功能的影响:MTT实验、平板克隆实验验证HAS2-AS1在卵巢癌细胞生长增殖中的作用;Transwell实验检测HAS2-AS1对卵巢癌细胞侵袭和迁移能力的影响;利用WesternBlot验证HAS2-AS1对EMT过程标志性蛋白表达的影响。
3.探究HAS2-AS1对卵巢癌细胞顺铂耐药性的影响
通过qRT-PCR检测A2780和耐药株A2780/DDP细胞中HAS2-AS1表达水平;对卵巢癌细胞进行顺铂梯度浓度药物刺激，通过MTT和耐药平板克隆实验分析HAS2-AS1表达对卵巢癌细胞顺铂敏感性的影响。
4.验证HAS2-AS1与miR-186-5p相互作用关系
通过生物信息学分析预测HAS2-AS1下游miRNA分子，发现miR-186-5p是HAS2-AS1潜在靶点。双荧光素酶报告基因实验验证miR-186-5p与HAS2-AS1相互作用关系，qRT-PCR技术检测抑制HAS2-AS1后miR-186-5p表达水平变化。验证miR-186-5p在HGSOC组织和FT组织中的表达差异，Person相关性分析验证HAS2-AS1与miR-186-5p在肿瘤组织中表达的相关性。
5.探究浆液性卵巢癌中miR-186-5p的生物学功能
在卵巢癌细胞A2780和UWB1.289中转染miR-186-5pmimics与对照组nc，qRT-PCR验证过表达效率，通过MTT实验验证miR-186-5p在卵巢癌细胞生长增殖中的作用;Transwell实验检测miR-186-5p对卵巢癌细胞的侵袭和转移的影响;利用WB验证miR-186-5p对EMT过程标志性蛋白表达的影响;顺铂梯度浓度加药，MTT验证miR-186-5p对细胞顺铂耐药性的影响。
6.验证miR-186-5p下游靶基因Twist1
通过生物信息学分析预测发现miR-186-5p与Twist13UTR区具有结合位点，通过双荧光素酶报告实验验证miR-186-5p与Twist1之间的相互作用关系，qRT-PCR和WesternBlot实验分别检测过表达和抑制HAS2-AS1、miR-186-5p后，Twist1在mRNA和蛋白水平的表达变化。
7.Rescue拯救实验验证HAS2-AS1/miR-186-5p/Twist1调控轴
在A2780和UWB1.289中分别转染shNC，shHAS2-AS1，shHAS2-AS1和miR-186-5pinhibitor，构建三组细胞系。通过qRT-PCR技术检测RNA水平上miR-186-5p和Twist1在三组细胞中的表达情况;WesternBlot实验检测对Twist1蛋白表达的影响。通过MTT，平板克隆实验，Transwell实验，顺铂梯度浓度加药等实验检测对卵巢癌细胞增殖、侵袭转移能力和耐药性的影响，完成对HAS2-AS1/miR-186-5p/Twist1轴调控卵巢癌生物学功能机制的探索。
研究结果
1.在高级别浆液性卵巢癌组织标本中，HAS2-AS1的表达水平(p＜0.001)高于正常输卵管组织。HAS2-AS1表达升高与浆液性卵巢癌患者的临床总生存时间相关(p=0.011)。
2.细胞功能实验结果显示:相比于正常对照组(Negtive Control，NC)，A2780和UWB1.289细胞中，MTT检测发现HAS2-AS1能够促进卵巢癌的异常生长，平板克隆实验显示过表达HAS2-AS1后细胞克隆形成能力明显增强;Transwell实验结果显示HAS2-AS1过表达后，A2780和UWB1.289卵巢癌细胞向小室下方移动的细胞数目明显增多，细胞的侵袭和迁移能力显著增强，抑制HAS2-AS1后细胞结果相反;EMT过程标志性分子(E-Cad、N-Cad、ZEB1、Vimentin)发生变化，抑制HAS2-AS1表达后，上皮标志物E-Cad蛋白表达上调，间质标志物N-Cad、ZEB1、Vimentin等蛋白表达降低，过表达HAS2-AS1后结果相反。
3.耐药相关性实验结果显示，与A2780细胞相比，HAS2-AS1在A2780/DDP耐药细胞中存在明显的表达升高。顺铂梯度浓度加药结果显示，抑制HAS2-AS1的表达使细胞在顺铂培养环境中存活率降低，细胞对顺铂的敏感性增加。过表达HAS2-AS1后细胞活性上升，对顺铂的耐药性增加。
4.生物信息学分析结果显示，HAS2-AS1与miR-186-5p存在互补结合位点。双荧光素酶报告实验显示，过表达miR-186-5p能使野生型质粒的荧光强度减弱，突变结合位点后，突变型质粒的荧光强度变化不明显，说明miR-186-5p与HAS2-AS1之间存在相互作用。qRT-PCR检测结果表明，抑制HAS2-AS1的表达能够使miR-186-5p表达水平升高，HAS2-AS1可以负性调控miR-186-5p的表达。高级别浆液性卵巢癌组织标本中miR-186-5p表达异常降低(p=0.0176)，Person相关性检验结果显示肿瘤组织中HAS2-AS1与miR-186-5p表达呈负相关。
5.miR-186-5p细胞功能实验结果表明，过表达miR-186-5p能够抑制细胞的增殖、侵袭转移能力，并且使细胞顺铂敏感性增加。
6.生物信息学分析发现miR-186-5p种子序列与Twist1mRNA的3UTR区有结合位点。双荧光素酶报告实验表明，转染野生型Twist1序列后，miR-186-5pmimics组能够显著抑制荧光素酶的活性，而突变型质粒的荧光强度变化值没有差别，表明miR-186-5p能够与Twist1在预测位点结合。沉默HAS2-AS1表达或过表达miR-186-5p后能够显著抑制Twist1mRNA和蛋白表达水平;过表达HAS2-AS1或抑制miR-186-5p后Twist1表达水平随之升高，表明HAS2-AS1与Twist1之间存在正向相关性，miR-186-5p负性调控Twist1的表达。
7.Rescue拯救实验结果显示，共转染shHAS2-AS1和miR-186-5pinhibitor会部分逆转HAS2-AS1沉默所引起的卵巢癌细胞增殖和侵袭迁移能力的抑制，使细胞对顺铂敏感性降低，耐药性增加。qRT-PCR和WesternBlot结果显示，抑制HAS2-AS1的表达可以使Twist1在mRNA和蛋白水平表达降低，并且这种抑制作用受到miR-186-5p的负性调控。说明HAS2-AS1能通过竞争性结合miR-186-5p调控Twist1的表达，促进浆液性卵巢癌的发生发展。
研究结论
1、HAS2-AS1在浆液性卵巢癌中普遍表达升高，与患者不良预后相关。
2、HAS2-AS1促进卵巢癌的异常增殖和侵袭转移，引起卵巢癌顺铂耐药。靶向阻遏HAS2-AS1的表达，可负性调控卵巢癌的恶性生物学行为。
3、HAS2-AS1通过竞争性结合miR-186-5p调控Twist1的表达，促进浆液性卵巢癌的发生发展。