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本论文研究内容主要包括两部分:
1、多形汉逊酵母N-糖基化代谢途径的改造
汉逊酵母作为重要的外源基因表达系统被广泛用来生产重组药物蛋白。然而,由于酵母本身存在异源高甘露糖糖基化修饰,利用该系统生产人类用糖蛋白存在很大限制。在本研究中,首次克隆、鉴定并分析了汉逊酵母N-连接糖代谢HpALG11和HpRFT1基因,利用葡萄糖氧化酶(GOX)为模式糖蛋白阐明了两个基因的功能。研究表明:HpALG11基因功能是在内质网胞质外侧特异性添加末端α-11,2-甘露糖形成中间体MansGlcNAc2-PP-dol,该基因缺失会导致其突变株生长缓慢并具有温度敏感致死性；HpRFT1基因编码一个保守的蛋白在协助中间体Man5GlcNAc2-PP-Dol从胞质外侧翻转到内质网腔内起到至关重要的作用,同时HpRFT1基因过表达能够在一定程度上弥补HpALG11基因缺失造成的生理缺陷。此外,我们采用一种新策略在过表达HpRFT1基础上,敲除HpALG3和HpALG11基因重建了汉逊酵母N-糖基化途径。该工程菌能以人源核心聚糖糖骨架形式(Man3GlcNAc2)为主要成份分泌表达rGOD糖蛋白,这项工作为改造汉逊酵母作为宿主表达人源糖基化蛋白奠定了基础。
2、HSP gp96在汉逊酵母中的表达及功能研究
HSP gp96是热休克蛋白90家族成员,在参与抗原呈递和作为分子伴侣引起免疫反应方面起到重要作用。本文在汉逊酵母高效表达重组rgp96蛋白方面进行了以下研究:首先,构建rgp96表达载体,应用α-淀粉酶报告系统筛选出重组汉逊酵母高表达rgp96克隆；其次,5L发酵罐进行发酵工艺优化,rgp96蛋白含量达250-300mg/L；最后,使用Ni柱亲和层析、Q柱离子交换和凝胶过滤方法从汉逊酵母菌体中纯化得到rgp96蛋白进行构象分析,多肽结合分析,BALB/c小鼠疫苗实验和酶联免疫斑点分析。实验结果表明rgp96蛋白具有以下特性:纯度高(>95％),体外以寡聚体形式存在,具有与HBcAg87-95肽结合的能力,能够提高乙肝疫苗免疫水平和抗体滴度以及提早激活抗体产生的效果,在联合多肽疫苗免疫中具有良好的佐剂功能。