【摘 要】
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天女木兰（Magnolia sieboldini K.Koch）是木兰科木兰属落叶小乔木,国家重点保护野生植物,具有极高的观赏和经济价值。目前,天女木兰主要靠播种繁殖,由于种子具有形态生理休眠特性限制了其繁殖和推广。A类PP2C是ABA信号转导途径中重要的负调节因子,对于揭示种子休眠解除的作用机制具有重要意义。本研究基于课题组天女木兰种子转录组数据,通过基因克隆,获取了三个天女木兰A类PP2C基因
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天女木兰（Magnolia sieboldini K.Koch）是木兰科木兰属落叶小乔木,国家重点保护野生植物,具有极高的观赏和经济价值。目前,天女木兰主要靠播种繁殖,由于种子具有形态生理休眠特性限制了其繁殖和推广。A类PP2C是ABA信号转导途径中重要的负调节因子,对于揭示种子休眠解除的作用机制具有重要意义。本研究基于课题组天女木兰种子转录组数据,通过基因克隆,获取了三个天女木兰A类PP2C基因（Ms AHG1、Ms AHG3、Ms HAB1）全长。通过实时荧光定量PCR技术,探究天女木兰Ms AHG1、Ms AHG3、Ms HAB1基因在不同组织中、种子吸胀过程中、种子休眠解除过程中的表达模式。利用单酶切同源融合的方法构建植物重组表达载体,通过亚细胞定位和拟南芥遗传转化对基因功能进行验证,为揭示天女木兰ABA信号传导在种子休眠解除过程中的分子作用机制提供科学依据。主要研究结果如下:1.成功克隆了天女木兰Ms AHG1、Ms AHG3、Ms HAB1基因,开放阅读框全长分别为1269 bp、1209 bp、1695 bp,编码422、402、564个氨基酸。Ms AHG1、Ms AHG3、Ms HAB1蛋白均为非跨膜的亲水蛋白,都具有PP2Cc结构域,属于PP2Cc家族。同源进化树显示,天女木兰的Ms AHG1、Ms AHG3、Ms HAB1分别与沉水樟的Cm AHG1、Cm AHG3、Cm HAB1亲缘关系比较近。2.Ms AHG1、Ms AHG3、Ms HAB1基因的表达模式分析,发现Ms AHG3基因在干种子中表达量最高,极显著高于Ms HAB1和Ms AHG1基因。在天女木兰种子吸胀过程中,Ms AHG1和Ms AHG3基因响应吸胀过程。与干种子相比,Ms AHG1基因在吸胀6-48 h的相对表达量均高于Ms AHG3基因,表明其在吸胀过程中起主要调控作用。在天女木兰休眠解除过程中,Ms AHG1、Ms AHG3、Ms HAB1基因表达量总体呈“先下降再上升”趋势,均在16 d时最低。Ms AHG3基因在整个休眠解除过程中的表达量均高于Ms AHG1和Ms HAB1,表明其在种子休眠解除过程中起主要调控作用。3.成功构建了p RI101-Ms AHG1-GFP、p RI101-Ms AHG3-GFP、p RI101-Ms HAB1-GFP植物表达载体。烟草亚细胞定位发现Ms AHG1、Ms AHG3和Ms HAB1都定位在细胞核中,与亚细胞定位预测结果一致。4.通过Ms AHG1过表达、Ms AHG1功能恢复、ahg1突变体和Col-0萌发率的比较发现,Ms AHG1过表达转基因种子对ABA不敏感,ahg1突变体对ABA敏感,而Ms AHG1功能回补转基因种子能够降低ABA的敏感性。通过Ms AHG3过表达、ahg3突变体和Col-0萌发率的比较发现,Ms AHG3过表达转基因种子对ABA不敏感,而ahg3突变体对ABA敏感。通过Ms HAB1过表达、hab1突变体和Col-0萌发率的比较发现,Ms HAB1过表达转基因种子能够降低ABA的敏感性,而hab1突变体对ABA敏感。
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