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线粒体膜间隙是线粒体内、外膜之间的一个狭小且相对封闭的空间,现已确定的人类线粒体膜间隙蛋白质仅40余种,约为线粒体总蛋白的4％。这些为数不多的蛋白质参与调控多种重要的生物学过程,包括线粒体蛋白转运定位、细胞凋亡、氧化磷酸化、能量代谢及氧化还原状态调控等。为了更好的理解线粒体膜间隙蛋白质组的功能构建及其生物学性质,本实验室前期采用规模化酵母双杂交筛选策略分析了23个人类线粒体膜间隙表达蛋白质及18个线粒体内、外膜蛋白质的相互作用,共获得49对非冗余的蛋白质相互作用,涉及36种蛋白质。生物信息学和独立的pull-down分析验证了酵母双杂交所获相互作用数据的可靠性。 在前期研究的基础上,本学位论文整合诱饵间的已知相互作用数据,构建了涉及36种蛋白质的57对相互作用的线粒体膜间隙蛋白质相互作用网络(IMSPN),网络中48对是新的相互作用。该网络由一个包含34种(86.1％)蛋白质的最大连通子网和1个小网络组成。对IMSPN生物学特性进行分析,发现IMSPN具有生物网络的基本特性。与大规模人类蛋白质相互作用网络相比, IMSPN中不同功能蛋白质间倾向于发生相互作用;IMSPN中富集小鼠同源蛋白质编码基因敲出后出现明显表型的蛋白质(以下简称表型蛋白质),这些蛋白质易于发生高频率的直接相互作用;21种未报道表型蛋白质可与表型蛋白质发生直接相互作用,提示IMSPN中可能包含更多的表型蛋白质。IMSPN的这些特点与IMS的特殊性相一致,即狭小空间内既不可能容纳较多蛋白质,又需承担多种复杂功能。此外,我们还从网络中预测了数个表型蛋白质、疾病候选蛋白质、未知功能蛋白质的功能和已知功能蛋白质的新功能,为进一步开展相关研究提供了指导信息。通过实验研究证明GFER(HPO205)通过与COX6B1相互作用调节呼吸链复合体Ⅳ的活性和组装。 基于网络分析,选择IMSPN中的核心蛋白质HPO205进行了深入研究。在肝癌细胞系SMMC-7721中过表达HPO205,可以增强线粒体功能,减少辐射引起的线粒体途径依赖的细胞凋亡;干涉HepG2细胞中HPO205的表达,细胞增殖及存活能力减弱,辐射敏感性增强。这些结果表明线粒体功能的增强是HPO205促使细胞抗凋亡能力增强的主要原因。线粒体功能稳态与精子发育有密切关联,为研究HPO205在精子发生中的作用,利用pTSPY2.4启动子制备了HPO205特异表达于睾丸组织的转基因小鼠,并对小鼠的表型进行了分析。发现HPO205在小鼠睾丸组织中的持续过表达影响了生精细胞的发育与分化,主要表现为:小鼠初级精母细胞增多,随即精母细胞凋亡比率增高,生精上皮腔内出现变性细胞,成熟精子减少并伴有精子活动度降低,畸形精子增多。HPO205的高表达最终导致转基因小鼠生育能力下降。这些结果表明HPO205参与精子发生过程的调节。 综上所述,分析了线粒体膜间隙蛋白质相互作用网络的生物学意义,并对核心蛋白质HPO205的功能进行了初步研究,为揭示线粒体膜间隙蛋白质的功能及调控机制乃至其在疾病发生发展中的作用提供了重要线索。