巫山淫羊藿种子休眠机制及解除方法研究

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巫山淫羊藿(Epimedium wushanense)为小檗科药用植物,本论文以巫山淫羊藿种子为试验材料,研究了种子萌发及种胚发育过程对氟啶酮、赤霉素、温度的响应特征,分析了巫山淫羊藿种子在不同温度层积条件下脂肪酸代谢和内源激素代谢规律;结合休眠特性研究和方法筛选,建立了巫山淫羊藿整齐萌发的休眠解除方法。同时,论文对生理休眠、形态休眠解除分别涉及到的基因、蛋白质进行了深入研究,探讨了巫山淫羊藿种子休眠解除机制。主要研究结果如下:1.巫山淫羊藿种子为非深度复杂型形态生理休眠种子,变温层积可解除生理休眠,低温层积可解除形态休眠。种子具有内源萌发抑制物质,系统分离后各组分对黑麦草根的抑制效应表现为丙酮相>甲醇相>水相>乙酸乙酯相,对芽的抑制效应表现为丙酮相>乙酸乙酯相>正己烷相>甲醇相。2.筛选出了最优的氟啶酮、赤霉素处理组合:2.5 mg.L-1氟啶酮与400 mg.L-1赤霉素。变温层积90 d种子,发芽率、发芽势、发芽指数比对照分别增加33.7%、431.1%、58.1%,平均发芽时间减少13.6%。变温层积150 d种子,发芽率、发芽势、发芽指数分别比对照增加103.3%、1675.0%、25.0%,平均发芽时间减少19.2%。3.变温层积可加速巫山淫羊藿种子在后续低温层积中的脂肪酸代谢。未经变温层积和经变温层积120 d的种子,低温层积90 d后,脂肪含量分别减少1.9%和2.8%;氟啶酮也可加快脂肪酸代谢速度,3.0mg·L-1、5.0mg·L-1、10 mg·L-1氟啶酮处理变温120 d的种子,低温层积90 d后,脂肪含量分别减少3.0%、2.1%和5.4%。4.通过Illumina Hiseq 2500测序平台,对处于3种不同休眠状态的巫山淫羊藿种子进行了RNA-seq测序,共获得了25.30 Gb可用的测序数据,其中包括79107个非冗余Unigene,平均长度为644.25bp。其中,32384个序列被NR、Swiss-Prot、Pfam、KOG、COG、GO和KEEG七个数据库注释到。GO显著性富集分析与KEGG显著性富集分析结果表明,生理休眠与形态休眠解除过程中,差异基因富集到功能类别及代谢途径具有较高相似性,但基因表达行为不同。5.采用iTRAQ技术,对3种不同休眠状态的巫山淫羊藿种子进行蛋白质组学研究,以转录组Unigene为蛋白数据库进行搜库,共鉴定到550个非冗余蛋白,生理休眠解除过程中共鉴定到369个差异表达蛋白,形态休眠解除过程中共鉴定到338个差异表达蛋白。6.种子生理休眠解除过程中,磷酸戊糖途径关键酶6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶表达水平显著增加,脂肪酸代谢、线粒体及内质网中相关酶基因表达显著上调,脂肪酸利用较为活跃。在形态休眠解除过程中,糖类物质向戊糖转化能力下降,6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶表达显著下调。脂肪酸代谢途径中,线粒体和内质网中相关酶基因表达显著下调,细胞质乙酰CoA羧化酶表达显著上调,脂肪酸合成活动较为活跃。
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