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本研究的目的在于系统开展鸡和鹅IL-2基因的克隆和体外表达，获得禽类IL-2基因遗传稳定性、体外最佳表达参数和生物学活性等方面的相关数据、制备抗鸡和鹅IL-2的单克隆和多克隆抗体、建立鸡和鹅IL-2含量的检测体系、探讨禽类IL-2作为疫苗佐剂的效果，为IL-2的应用研究奠定基础。 对鸡、鸭、火鸡IL-2的核苷酸序列进行比较，在其保守区设计引物，通过RT-PCR方法扩增和克隆了鹅白介素2(goIL-2)的核苷酸序列。该基因由768nt组成，编码一由141个氨基酸组成的前体蛋白。基因5’和3’端分别含有35个和307个核苷酸组成的非编码区，3’端非编码区含有7个‘ATTTA基序。goIL-2核苷酸序列和氨基酸序列与鸭IL-2核苷酸序列和氨基酸序列的同源性分别为90.1％和83.6％，与鸡IL-2核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为73.9％和63.1％，与火鸡IL-2的核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为75％和63.1％，与鹌鹑IL-2的核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为69.7％和61.0％，与人IL-2的核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为29.8％和14.9％，与其他哺乳动物IL-2核苷酸和氨基酸序列的同源性分别在25-30％左右和14-17％左右。氨基酸序列分析表明，N端存在一长21个氨基酸的信号肽，含有形成2个链内二硫键的4个半胱氨酸。goIL-2mRNA的体外表达动力学分析表明，脾脏T淋巴细胞经Con A诱导2h至48h均可检测到goIL-2mRNA的表达。三维结构预测表明，goIL-2蛋白由A、B、C、D4个α-螺旋和2个β-折叠构成。遗传进化分析表明，goIL-2和鸭IL-2的亲缘关系最近。 将去除信号肽的chIL-2cDNA亚克隆到原核表达载体pBAD/HisB和pET28a(+)，构建重组表达载体pBAD-chIL-2和pET-chIL-2，重组载体分别转化菌株E.coli LMG194和BL21(DE3)，重组菌分别以L-(+)-阿拉伯糖和IPTG进行诱导，实现了重组鸡IL-2(rchIL-2)蛋白在大肠杆菌的高效表达。SDS-PAGE和Western blot分析显示，表达蛋白的分子量约为18.4kDa。可溶性鉴定表明，经pET28a(+)表达系统表达的rchIL-2主要以包涵体的形式存在，而经pBAD/His B表达系统表达的rchIL-2以不溶和可溶两种形式存在。经pBAD/HisB和pET28a(+)两种表达系统表达的重组蛋白采用Ni2+纯化，从每升培养液中分别可获得4.2mg和8.2mg rchIL-2。 将去除信号肽的goIL-2cDNA插入到原核表达载体pBAD/HisB和pET28a(+)，构建重组表达载体pBAD-goIL-2和pET-goIL-2，重组载体分别转化菌株E.coli LMG194和BL21(DE3)，实现了重组goIL-2(rgoIL-2)蛋白在大肠杆菌的高效表达。SDS-PAGE和Western blot分析显示，表达蛋白的分子量约为20kDa。可溶性鉴定分析表明，经pET28a(+)表达系统表达的rgoIL-2主要以包涵体的形式存在，而经pBAD/His B表达系统表达的rgoIL-2以不溶和可溶两种形式存在。经pBAD/HisB和pET28a(+)两种表达系统表达的重组蛋白采用Ni2+层析柱进行变性纯化，从每升培养液中分别可获得4.8mg和8.6mg rgoIL-2。 以纯化的rchIL-2为免疫原，按常规方法免疫BALB/c小鼠，取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，对杂交瘤细胞进行筛选，最终获得4株持续、稳定分泌抗chIL-2的单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞株，分别命名为:1A12、4A3、3E7和4E1。对4株mAb亚型鉴定结果表明，其抗体类型均为IgG1，κ。Western-blot分析表明，所获得的4株mAb，与鸡IL-2均具有反应性，与重组鸭IL-2(rduIL-2)蛋白均没有反应性，仅mAb/3E7与rgoIL-2能发生反应。阻断实验证明，4株chIL-2mAb均无chIL-2蛋白的中和性功能表位。 以纯化的抗chIL-2mAb/3E7为包被抗体，以变性纯化的rchIL-2为标准抗原，以纯化的chIL-2多克隆抗体为检测抗体，建立了简便、特异、灵敏的抗原捕获ELISA检测体系。此法具有较好的重复性，其批内CV值为7.8％，批间变异系数CV为8.0％。当mAb包被浓度为2.5μg/ml，多抗浓度为10μg/ml，其测定范围为6.3ng/ml～500ng/ml，检测下限为3.13ng/ml。 构建了chIL-2真核重组表达载体pEGFP-chIL-2和pCI-neo-chIL-2，观察了chIL-2在Vero和COS-7细胞中的表达动力学，验证了4株鸡IL-2mAb与真核表达的chIL-2的反应性。通过追踪荧光蛋白的表达情况显示，pEGFP-chIL-2转染Vero和COS-7细胞后的3h均可观察到荧光蛋白的表达，转染后24h和48h表达荧光蛋白的细胞数目达到峰值。抗原捕获ELISA检测chIL-2的体外表达动力学表明，pCI-neo-chIL-2转染COS-7细胞后72hchIL-2的表达量最高。免疫细胞化学检测结果显示，4株chIL-2mAb均能特异的识别经Vero和COS-7细胞表达的蛋白，说明4株针对原核表达的chIL-2蛋白的mAb均具有chIL-2的抗原识别表位。 将goIL-2编码框亚克隆入真核表达载体pEGFP-c2和pCI-neo，并通过脂质体介导转染Vero和COS-7细胞。体外表达动力学表明，pEGFP-goIL-2转染Vero和COS-7细胞后的3h和4h可观察到绿色荧光蛋白的表达，转染后24h和32h表达荧光蛋白的细胞数目达到峰值。免疫细胞化学检测结果证明，5株goIL-2mAb均能特异的识别经Vero和COS-7细胞表达的蛋白，说明goIL-2确实已在Vero和COS-7细胞中表达，且5株针对原核表达的goIL-2蛋白的mAb均具有goIL-2的抗原识别表位。 将不同剂量的pCI-neo-chIL-2质粒、rchIL-2蛋白以及pCI-neo-chIL-2/rchIL-2组合与禽流感疫苗联合免疫7日龄含有高滴度AIV母源抗体鸡(免疫鸡)以及14日龄SPF鸡。测定pCI-neo-chIL-2、rchIL-2对H5亚型禽流感油乳剂疫苗免疫增强效果的影响。SPF鸡各实验组的数据分析显示，在免疫后30天内，200μg pCI-neo-chIL-2质粒组无显著的免疫增强效果(p＞0.05)，而400μg和800μg质粒组具有显著的免疫增强效果(p＜0.05)，且400μg和800μg质粒组之间无显著差异(p＜0.05)。100ng、200ng和250ng rchIL-2蛋白组均不能显著提高AIV的抗体滴度(p＞0.05)，300ngrchIL-2组在免疫后22天内有显著的免疫增强效果，350ng、400ng和600ngrchIL-2组在免疫后30天内均有显著的增强效果(p＜0.05)，且组间差异不显著(p＞0.05)。800ng、1μg和2μg rchIL-2免疫组在免疫后30天内有极显著的增强效果(p＜0.01)，且组间差异不显著。5μg和10μg rchIL-2均无显著的增强效果（p＞0.05)。母源抗体鸡各实验组的数据分析显示，在免疫后30天，在不同剂量的pCI-neo-chIL-2质粒免疫组中，以400μg和800μg剂量组提高的抗体水平最明显，在不同剂量的rchIL-2蛋白免疫组中以350ng～600ng蛋白免疫组的增强效果较显著。这些结果说明，不管雏鸡具有AIV母源抗体还是不具有母源抗体，chIL-2对AIV疫苗均具有明显的免疫佐剂作用。在本试验中，同时也说明，AIV母源抗体对AIV疫苗的免疫效果具有很大的影响。 将不同剂量的真核表载体pCI-neo-goIL-2和重组goIL-2(rgoIL-2)蛋白与禽流感疫苗联合免疫22日龄的浙东白鹅，测定其对禽流感油乳剂灭活疫苗(H5N2)的免疫增强作用。对质粒免疫组的AIV抗体效价统计分析表明，在免疫后30天内，100μg和200μg真核表达质粒均不能显著提高AIV的抗体滴度(p＞0.05)，而400μg和800μg真核表达质粒具有显著的免疫增强效果(p＜0.01)。对rgoIL-2蛋白免疫组的AIV抗体效价统计分析显示，200ng、250μg、250μg、300μg和350μg rgoIL-2在免疫后无明显的佐剂效果(p＞0.05);300ng和350ng rgoIL-2在免疫后均具有显著的免疫增强效果(p＜0.01)，但组间无显著差异(p＞0.05)。rgoIL-2蛋白+pCI-neo-goIL-2联合免疫组的AIV血凝抑制抗体数据分析显示，400μgpCI-neo-goIL-2+300ng rgoIL-2蛋白联用免疫组与对照组的抗体滴度呈显著差异(p＜0.01)，但与单独使用400μg pCI-neo-goIL-2或300ng rgoIL-2蛋白免疫组无显著性差异(p＞0.05)。