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红树林是分布于热带海岸潮间带的木本植物群落,是热带海岸重要的植被类型,是维护海岸生态平衡的特殊生态系统。红树林生态系统处于海洋与陆地的动态交接面,是不同于陆地生态系统也不同于海洋生态系统的独特的海陆边缘生态系统。在全球生态平衡中起着不可替代的重要作用。红树林生态系统在抵抗潮汐防护海岸、净化陆地径流和工农业生产活动带来的污染中起着重要的作用。被人们誉为——“海上森林”。由于不合理的开发利用,全世界的红树林都面临着资源枯竭的严重境地。为保护和可持续利用这一独特资源,各有关国家开展了许多研究。但研究多集中在生理学、生态学、生物化学等领域,用分子标记研究红树自然种群的遗传结构的研究较少。本研究采用RAPD-PCR和ISSR-PCR两种分子标记方法进行木榄属亲缘关系鉴定和桐花树遗传多样性研究,主要工作如下: 1.本研究优化了红树植物桐花树ISSR-PCR扩增反应的体系。ISSR-PCR扩增总体积为20μL。包括10×PCR缓冲液2μL,25mmol MgCl21.6μL,1mmol/LdNTPs4μ L,5μ mol/L引物1.6μL,20ng的DNA模板4μ L,5UTaq聚合酶0.2μL,无菌水6.6μL。PCR循环设置为:94℃预变性5 min后,94℃变性30 sec,52℃退火45 sec,72℃延伸2 min,共45个循环,然后72℃延伸7 min。 2.用随机扩增多态性DNA(RAPD-PCR)和inter-简单重复序列(ISSR-PCR)分子标记技术对木榄属(Bruguiera)3种红树木榄(Bruguieragymnorrhiza)、海莲(B.sexangula)、尖瓣海莲(B.sexangulavar.rhynchopetala)进行遗传亲缘关系研究。12个RAPD-PCR引物和10个ISSR-PCR引物分别扩增出240和191条带,多态位点百分率分别为38.75%和52.88%,ISSR-PCR检测到的多态位点率高于RAPD-PCR。运用Nei指数法计算木榄-海莲、木榄-尖瓣海莲、海莲-尖瓣海莲之间的遗传距离,RAPD-PCR分析结果为0.47、0.36、0.29,ISSR-PCR分析结果为0.62、0.41、0.32。同时运用UPGMA统计法进行聚类分析,结果显示,海莲和尖瓣海莲聚为一组,木榄单独一组。结合宏观形态和等位酶资料,本研究把尖瓣海莲确定为海莲的变种。 3.采用RAPD-PCR和ISSR-PCR两种方法探讨广西三个不同滩涂生境条件下的桐花树种群的遗传多样性和遗传分化。RAPD-PCR和ISSR-PCR分析三种不同生境桐花树种群间的多态百分率分别为20.2%和28.95%,平均遗传距离分别为0.208和0.25。RAPD-PCR和ISSR-PCR方法测得桐花树种群的遗传多样性指数大冠沙种群、钦州种群、山口种群分别为0.17、0.331、0.225和0.296、0.331、0.321。结果显示,RAPD-PCR分析有62.3%变异来自种群内,ISSR-PCR分析有74.1%变异来自种群内。桐花树种群遗传变异性低,遗传分化程度低,大部分变异来自种群内。据此说明三种滩涂生境桐花树种群遗传变异小。 4.对厦门九龙江沿岸三个不同盐度生境下生长的桐花树种群的研究,结果显示:RAPD-PCR和ISSR-PCR分析三种盐度下桐花树种群间的多态百分率分别为20.10%和24.29%。种群间的平均遗传距离分别为0.221和0.23。RAPD-PCR和ISSR-PCR方法测得不同盐度下桐花树种群的遗传多样性指数海沧种群(盐度18.19‰)、浮宫种群(盐度13.40‰)、寮东种群(盐度10.06‰)分别为0.212、0.136、0.179和0.277、0.237、0.245。研究还表明:RAPD-PCR分析有73.22%的遗传变异来自种群内,ISSR-PCR分析有71.79%的遗传变异来自种群内。进一步说明,10.06‰-18.19‰盐度变化不是桐花树种群遗传分化的主要限制因子。 5.利用RAPD-PCR和ISSR-PCR两种分子标记,对四个不同纬度桐花树种群的遗传多样性和遗传分化进行探讨,根据RAPD-PCR和ISSR-PCR数据计算遗传距离并进行聚类分析,结果表明,四个不同纬度地区的种群桐花树遗传变异性低,四个纬度桐花树种群分为南北两个类群,海南和广西为一个类群,广东和福建为一个类群。并且,南部种群多态百分率和遗传多样性指数比北部种群高。桐花树可能起源于南部,也进一步说明红树植物是热带起源的,因此,桐花树的南部类群在研究其起源和演化中将显得更为重要。利用Shannons指数计算四个种群的遗传多样性,广西种群多样性指数最高,福建种群最低。大部分的遗传变异存在于种群内(64%),少部分的遗传变异存在种群间(36%)。桐花树的遗传分化与其空间关系密切,因此在人工引种栽培时,可以就近采种或从其多样性分布中心地区采种。 由以上结果分析可见,无论是不同滩涂生境、不同盐度生境、不同纬度地区红树植物桐花树的遗传变异水平都较低,且大部分的遗传变异存在于种群内。这与红树植物的生物学特性、分布生境的相对均质性及其水渍盐浸的强烈选择作用有关。因此,局部的少数种群的消减不会导致其遗传多样性的迅速丧失。但长期的人为破坏及改变其生境,仍会导致其种群的衰退,必须注意保护。