论文部分内容阅读
肿瘤不仅仅是与细胞异常增殖和分化有关的疾病，同时也是与细胞死亡异常相关的疾病。肿瘤的分子生物学研究表明，癌基因和原癌基因的激活与肿瘤的发生、发展之间有着极为密切的关系，此类基因的激活与表达不仅直接刺激了肿瘤的生长，亦阻断了肿瘤细胞的凋亡过程，同时能够诱导凋亡的基因产生突变，呈现低表达，二者共同作用使肿瘤细胞的凋亡程度相对于其过度的增值呈现过低的表现，因此细胞凋亡的减少在肿瘤细胞累积中起到重要作用。同时也有研究发现，当细胞凋亡受到抑制，尤其是与细胞周期失控并存时，能促进细胞发生恶性转化，并影响到肿瘤细胞对抗肿瘤治疗的反应。因此治疗肿瘤的一个有效途径就是诱导肿瘤细胞凋亡。
1972年，Kerr等首次提出生物学“细胞凋亡(cell apoptosis)”概念，细胞凋亡又称程序化细胞死亡(programmed cell death，PCD)，是细胞对非急性致死的有害刺激协调适应性反应得体现，是一种能量依赖性的、受细胞内部多种机制严格调控的细胞自杀式的死亡过程。与细胞坏死不同，其细胞的消失不伴有炎症反应出现。近年来，随着分子生物学的迅猛发展，对细胞凋亡研究不断深入，其在肿瘤发病机制、诊断治疗方面的重要作用日益受到生命科学工作者重视。
治疗肿瘤的机制之一是干扰DNA的合成及细胞的分裂，从而诱导肿瘤细胞产生凋亡，达到抑制或清除肿瘤的目的。而肿瘤对于治疗的敏感性，也往往是通过治疗后最初的肿瘤细胞凋亡程度而反应出来的。因此细胞凋亡的测定，已成为评估肿瘤疗效的一项新指标，此外，细胞凋亡实验也是筛选抗癌新药的快速、有效方法。
目前，对于体外细胞凋亡的检测有很多种方法[1]，包括：一、形态学观察方法，常用的观察方法有普通光镜观察法、荧光显微镜观察法和透射电镜观察法；二、琼脂糖凝胶电泳法，检测细胞凋亡的经典方法是抽提细胞DNA，琼脂糖凝胶中进行电泳分析，紫外灯下观察，可见相差180-200bp 大小的阶梯状条带图谱；三、流式细胞计数法，包括Hoechst 33342 染色法，Hoechst 33342/PI双染色法等；四、原位DNA 标记检测法等方法。
通过仪器对活体组织的凋亡细胞进行显像是近年发展起来得新技术，对于肿瘤治疗的设计与研究、治疗效果的检测非常有用，其活体凋亡细胞显像的原理是在细胞凋亡程序启动后，凋亡细胞自身会产生一系列的病理生理改变，在这一过程中将产生很多种可识别的、特异性的化学信号，利用这一特点，目前广泛使用的是将放射性核素标记的特定化合物引入体内并与之产生特异性的结合，在体外应用显像仪器检测体内放射性的分布。由于放射性核素凋亡细胞显像技术能够满足安全、早期、无创等条件，已成为目前研究最广泛的体内细胞凋亡检测技术。现在最常用的核素凋亡显像剂是99mTc标记的Annexin V类显像药物[2]。Annexin V是一种内源性生理蛋白，广泛存在于真核生物的各种器官及组织，99mTc-Annexin V与Annexin V的生理特性相同；磷脂酰丝氨酸（PS）是细胞膜上的成分之一，Annexin V对PS有具有很高的亲和力，正常时PS只存在于细胞膜的内侧，注入体内99mTc-Annexin V不能进入细胞膜与PS结合，因此不能显像，而细胞发生凋亡时，PS会发生重新分布，即细胞膜内表面的PS 翻转，发生不可逆的外露，在钙离子存在下，99mTc-Annexin V与PS快速而紧密的结合而显影。
本实验即根据以上的原理及方法，对经125I照射的细胞进行检测，观察125I诱导视网膜母细胞瘤细胞的凋亡情况；以及运用体外核素显像仪器检测125I粒子对视网膜母细胞瘤移植瘤的治疗效果，为临床治疗视网膜母细胞瘤转移瘤的研究应用提供实验依据。
目的：
探讨125I持续低剂量率照射诱导人视网膜母细胞瘤细胞凋亡的作用及研究125I粒子组织间植入近距离治疗小鼠移植性视网膜母细胞瘤的治疗效果。
方法：
细胞试验：1.实验组采用0.1mci～0.5mci的125I照射视网膜母细胞瘤细胞，诱导其凋亡。
2.对照组采用终浓度20umol/L、40umol/L的姜黄素加入到肿瘤细胞培养液内，观察姜黄素对细胞的诱导凋亡作用。
3.空白对照组、实验组、对照组及实验组＋对照组的结果，运用Hoechst 33258单染、流式细胞仪方法进行检测，比较其结果，观察125I的诱导凋亡作用及姜黄素的诱导凋亡协同作用。
动物实验：1.建立人视网膜母细胞瘤（SO-RB50瘤细胞）的严重联合免疫缺陷小鼠（即NOD-SCID鼠）皮下移植瘤模型。
2.治疗组行125I粒子颈部皮下移植瘤植入治疗。
3.对照组行不干预处理。
4.125I粒子照射20天后，治疗组，对照组通过比较其肿瘤体积大小、肿瘤病理组织切片及SPECT的肿瘤部位的显像，观察125I粒子近距离治疗视网膜母细胞瘤的治疗效果。
结果：
细胞实验：1、Hoechst 33258单染结果显示姜黄素组、125I照射组、及(姜黄素+125I)组都可以诱导视网膜母细胞瘤的凋亡；姜黄素终浓度20umol/L时对125I(0.1mci、0.3mci)组诱导细胞凋亡无协同作用，姜黄素终浓度40umol/L时对其有协同作用。
2、流式细胞仪检测细胞凋亡率显示姜黄素及125I都可诱导视网膜母细胞瘤细胞凋亡，姜黄素终浓度40umol/L时对125I诱导细胞凋亡有协同作用，动物实验：1.与对照组相比较，125I治疗组的肿瘤生长明显受到抑制，肿瘤抑制率为最高为56％。
2.HE染色病理切片显示，经125I粒子照射后，肿瘤组织出现大量的变性坏死的细胞及凋亡细胞。
3.SPECT显像结果表明，经粒子植入治疗后，由于出现大量凋亡坏死细胞，在肿瘤组织区域内可见明显的显影。
结论：
1.125I持续低剂量率照射可诱导人视网膜母细胞瘤细胞凋亡；
2.125I组织间植入对人视网膜母细胞瘤（SO-RB50瘤细胞）移植瘤有明显大的治疗效果。