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研究背景:MicroRNA (miRNAs)是一类内源性长约19-23个核苷酸的小分子非编码RNA,通常在转录后水平和翻译水平调控基因的表达。PGC-1α在肝脏中的主要作用是促进肝糖异生及调节脂肪酸氧化。本文主要通过体内外实验研究了miR-696对PGC-1α调控的分子机制及其在肝脏糖异生中的作用。研究方法：(1)采用western blotting和qRT-PCR技术分别检测ob/ob小鼠和C57BL/6小鼠肝脏组织中PGC-1α蛋白及miR-696的表达水平；(2)构建pre-miR-696-LV, pre-NC-LV, anti-miR-696-LV, anti-NC-LV慢病毒载体,分别感染小鼠原代肝细胞72h后,在荧光显微镜下观察各组细胞的感染情况,同时qRT-PCR和western blotting分别检测各组小鼠原代肝细胞中miR-696及PGC-1α蛋白的表达水平；(3)构建psiCHECK-2-PGC-1α3’UTR质粒,通过luciferase检测研究aiR-696对PGC-1α是否有直接的靶向作用；(4)选择肝脏糖异生关键酶PEPCK为指标,进一步研究miR-696抑制PGC-1α表达的生物学效应,采用western blotting检测ob/ob和C57BL/6小鼠肝脏组织及小鼠原代肝细胞中PEPCK蛋白的表达水平。研究结果：(1)研究发现ob/ob肥胖小鼠肝脏中PGC-1α的蛋白表达水平显著升高,是C57BL/6小鼠肝脏中表达水平的2.15倍；而ob/ob小鼠肝脏中niR-696的表达水平显著低于正常C57BL/6小鼠肝脏中miR-696的表达水平,仅为正常对照组的21%左右。此结果表明,在ob/ob小鼠和C57BL/6小鼠肝脏中miR-696与PGC-1α的表达水平呈显著的负相关关系。(2)慢病毒载体感染小鼠原代肝细胞72小时后,在荧光显微镜下观察到感染成功。‘RT-PCR分析发现,感染pre-miR-696-LV的小鼠原代肝细胞中miR-696表达水平显著升高,是对照组的6.7倍；而感染anti-miR-696-LV的小鼠原代肝细胞中miR-696表达水平显著下降,仅为对照组59%。Western blotting检查发现,感染pre-miR-696-LV的小鼠原代肝细胞中PGC-1α表达水平仅为对照组的41%;而感染anti-miR-696-ⅠV的小鼠原代肝细胞中PGC-1α表达水平是对照组的1.87倍。此研究结果表明,在小鼠原代肝细胞中miR-696对PGC-1α发挥着负调控作用。(3)Luciferase检测表明,过表达miR-696能够使luciferase报告活性下降62%；而敲除miR-696能够使luciferase报告活性显著上升17%。这提示miR-696能够直接识别PGC-1α的3’-UTR,调节PGC-1α蛋白的表达。(4) Western B1ot分析结果显示：在肝脏中,ob/ob小鼠PEPCK蛋白表达水平显著高于C57BL/6小鼠PEPCK蛋白的表达水平,是其1.47倍；感染pre-miR-696-LV后原代肝细胞中PEPCK蛋白表达显著下降,仅为对照组的37%,而敲除miR-696能显著提高PEPCK蛋白的表达,为对照组的1.51倍。此结果表明miR-696对PGC-1α的负调控作用会进一步影响肝脏糖异生关键酶的表达。结论：(1)MiR-696能够直接识别PGC-1α的3’-UTR,发挥着负调控PGC-1α表达的作用：(2)PGC-1α可能通过共激活转录因子HNF-4α、FOXO1调节肝脏糖异生关键酶PEPCK的表达,进一步影响肝脏糖异生和胰岛素抵抗的发生和发展。