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一氧化氮(Nitric Oxide，NO)作为一种重要的气体信号分子，对心血管系统、免疫系统和神经系统的功能调节和在信号转导中的作用已被广泛确认。其作用机制除了经典的cGMP依赖的信号通路外，NO还可以通过蛋白质的巯基亚硝基化修饰来介导其生物学活性。蛋白质的巯基亚硝基化修饰是指一氧化氮作用蛋白质半胱氨酸巯基-SH生成-SNO，是一氧化氮广泛调控细胞信号转导作用的重要途径，是一种典型的氧化还原依赖的可逆的蛋白质翻译后修饰。我们实验室之前的研究表明：NO能够通过对APE1(Apyrimidinic Endonuclease1)蛋白亚硝基化修饰诱导其出核，同时发现NO能够抑制经典的importinα依赖的核输入。因此，我们提出NO是否能够影响经典的CRM1(chromosomal region maintenance1)依赖的核输出信号通路?结果发现NO能够通过蛋白巯基的亚硝基化修饰调控CRM1与NES的相互作用，进而抑制经典的核输出信号通路。在蛋白质亚硝基化修饰功能研究的基础上，我们认识到蛋白质巯基亚硝基化的调控是一个重要问题，为此，我们对调控蛋白质巯基亚硝基化修饰关键蛋白GSNOR(S-nitrosoglutathionereductase)的功能进行了初步研究，并首次发现了该酶在细胞分化中的作用。本论文主要研究结果如下：
一、NO通过蛋白巯基亚硝基化修饰调控CRM1依赖的核输出经典的蛋白出核主要是通过亲核素家族成员CRM1这一受体介导的。我们的研究结果表明：外源或内源一氧化氮作用细胞能够引起CRM1蛋白巯基亚硝基化，从而破坏CRM1与核输出信号(Nuclear export signal，NES)之间的相互作用，并导致经典的核输出途径受到抑制。进一步，我们通过质谱分析以及位点突变分子生物学手段，确定了CRM1有两个特异的半胱氨酸位点(C528和C585)，它们中间任意一个发生亚硝基化修饰都能够破坏CRM1和NES的结合。此外，在细胞内过表达不能发生亚硝基化修饰的CRM1突变体则能够挽回上述一氧化氮诱导的核输出抑制。说明蛋白质巯基亚硝基化是CRM1核输出功能抑制的主要机制。最后，我们进一步研究了CRM1亚硝基化修饰的细胞效应，发现一氧化氮对CRM1的功能抑制能够促进Nrf2(Nuclear factor E2-related factor-2)的核聚集以及Nrf2下游基因NQO1(NAD(P)H∶quinone oxidoreductase1)和HO-1(Humanheme oxygenase1)的转录激活，表明细胞在一氧化氮应激条件下通过亚硝基化修饰CRM1促进细胞内保护基因转录激活，是一种新的细胞保护机制。
二、GSNO还原酶参与调控NGF诱导的PC12细胞分化过程研究表明：NO是NGF诱导PC12细胞分化所必需的，但以往研究仅关注NO合酶NOS的作用，而对于NO代谢调控在分化过程中的作用还未见报道，并且NO介导的蛋白亚硝基化修饰及调控是否也在分化过程中起作用还不清楚。GSNOR是调控内源NO代谢和蛋白质巯基亚硝基化的关键蛋白。在本研究中，我们首先发现在NGF诱导的PC12分化过程中GSNOR与NOS一样在mRNA水平、蛋白表达和酶活水平都得到上调。为确定GSNOR的这种调控是否在分化中起作用，我们构建了GSNOR的RNA干扰的PC12细胞和GSNOR过表达PC12细胞。发现通过小RNA干扰下调PC12细胞内的GSNOR能促进NGF诱导的PC12的分化；而过表达GSNOR则能够抑制NGF诱导的PC12的分化。研究结果表明GSNOR参与调控NGF诱导的PC12细胞分化过程。深入机理还在进一步研究中。