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本研究基于前期工作基础，已构建华癸中慢生根瘤菌7653R Tn5-sacB转座子突变体库，通过植物盆栽筛选获得7653R共生缺陷突变株HK115和HK483，二者与宿主植物紫云英的共生表型均为结瘤不固氮（nod+fix-）。利用TAIL-PCR方法克隆Tn5插入位点旁侧序列，与GenBank已公布基因组序列比较分析后，根据同源基因设计合适引物克隆获得其基因全长序列，分别命名为dmtH和autoL。 dmtH编码一个由249个氨基酸残基组成的蛋白质，分子量为27.3KDa。Blastn分析和蛋白质结构域预测表明：DmtH与去甲基甲基萘醌（DMK）甲基转移酶高度同源，仅在少数根瘤菌中分布。该蛋白催化电子传递载体甲基萘醌(MK)合成的最后一步，即依赖腺苷甲硫氨酸的转甲基反应。 为进一步研究dmtH在共生固氮中的功能，构建了dmtH的kan插入失活突变株HK116，该突变株诱导紫云英形成白色无效根瘤，且与野生型菌株7653R比较竞争结瘤能力降低。根瘤切片和电镜观察结果显示：HK116形成根瘤中仅含少量形态异常的类菌体，类菌体膜增厚，胞内可观察到明显PHB颗粒积累。dmtH互补表达载体pBBRgus-dmt能够恢复HK116的固氮功能，表明HK116的共生突变表型仅由dmtH突变所引起，确证了DmtH为根瘤菌7653R共生固氮所必需。 微氧培养时，突变株HK116胞内积累PHB相对含量达0.0937g/gDW，为野生型菌株7653R胞内PHB的2.46倍。好氧培养时，HK116在胞内PHB相对含量、生长速度和碳源利用能力等方面与7653R无显著差异，表明dmtH突变对好氧自生培养时根瘤菌7653R的生理特性没有明显影响，仅对微氧培养时PHB的代谢产生影响。荧光定量分析显示dmtH在自生培养细胞中基本不表达，而在接种根瘤菌25天后的根瘤中表达量最高，表明dmtH为共生特异诱导表达基因，在根瘤菌共生固氮阶段发挥功能。 基于对DmtH蛋白的功能预测，我们认为华癸中慢生根瘤菌7653R在共生固氮期间可能以甲基萘醌作为电子传递载体，但缺乏相关实验证据和文献报道。因此，本研究对7653R和突变株HK116在好氧和微氧培养条件下的醌组分进行了提取、高压液相色谱及质谱的比较鉴定。结果表明：好氧培养时，7653R中仅积累泛醌（UQ-10），微氧培养时则有甲基萘醌（MK-7）产生，而突变株HK116则没有甲基萘醌的产生。基于dmtH为共生特异表达基因，本研究合理推测该根瘤菌在共生期间可以甲基萘醌作为电子受体。 依据DMK转甲基酶对异戊二烯侧链的专一性不强，本研究利用大肠杆菌ubiE基因突变株JC7623Δ4-1仅产生DMK-8的特点，以之作为反应底物，通过体外酶活反应体系测定了DmtH转甲基活性。结果表明：以腺苷甲硫氨酸作为甲基供体，DmtH蛋白能够催化合成甲基萘醌，从而直接证明了DmtH具有转甲基酶活性功能。 autoL基因突变株亦形成无效根瘤，其编码产物由371个氨基酸组成，预测分子量41.5KDa。基因序列和蛋白质结构分析表明：AutoL蛋白属于糖苷键水解酶超家族蛋白，且与该家族的自溶酶蛋白序列高度同源，该酶参与细菌细胞壁的更新、细胞的分裂及病原菌感染寄主时的防御过程。本研究利用SOE-PCR和基因置换技术获得了autoL插入突变株HK1003，该突变株与紫云英共生形成白色无效根瘤，根瘤切片和电镜观察表明：突变株HK1003形成的根瘤中含菌细胞少，类菌体个体小且分化异常，胞内含少量PHB颗粒。另外，共生体膜也被观察到存在加厚的异常现象。因此，autoL可能与根瘤菌细胞壁的分解和抵抗植物的防御反应相关，从而影响共生体膜形成和类菌体分化，是根瘤菌共生固氮过程的必需基因。