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AP-2是一个重要的转录因子家族,参与了哺乳动物胚胎发育、细胞分化和癌症形成中许多基因的转录调控。AP-2因子都执行着关键的、重复的但又独特的功能。最近研究也表明AP-2相互作用的因子调节了其下游靶基因的活性从而影响了一系列的生物过程。为了识别更多AP-2相互作用的蛋白,我们执行酵母双杂交筛选,以AP-2α为诱饵蛋白筛选人脑cDNA文库,也以AP-2β为诱饵蛋白筛选HeLa cDNA文库。分别识别了两个阳性克隆:AP-2α筛选到KCTD1和Gemin4,而AP-2β筛选到GAS41和CKⅡβ。
在本论文中,我们首先分析了一个新的BTB蛋白KCTD1的特征。我们发现KCTD1是一个在进化过程中高度保守的蛋白,人类不同组织的Northern blot分析显示KCTD1高表达于乳腺,中度表达于肾脏,在脑和卵巢中也有少量表达。但是KCTD1的表达与乳腺恶化程度并没有明显的关系。此外,发现KCTD1是一个核蛋白,它通过BTB结构域调节了转录抑制功能,虽然KCTD1没有募集组蛋白去乙酰酶复合体的参与。而且该BTB结构域也调节了KCTD1蛋白的同源多聚化。
我们接下来通过体外的GST pull-down和体内的免疫共沉淀试验证明了KCTD1租AP-2α之间确实存在着相互作用,免疫荧光分析也表明两者定位在相同的细胞结构。而且两个蛋白相互作用区域分别定位到KCTD1的N端BTB结构域和AP-2α的N端激活结构域,尤其是在AP-2α的PY结构域中第61位的脯氨酸对于与KCTD1的相互作用是至关重要的。此外,我们发现KCTD1与AP-2α的相互作用极大地抑制了AP-2α的转录活性,而KCTD1小干扰RNA强烈地缓解了这个转录抑制。然而,其它BTB蛋白(PDIP1,KCTD10和TNFAIP1)对AP-2α的转录活性没有显著影响。而且KCTDl与AP-2家族其它成员(AP-2β和AP-2γ)也可发生相互作用并抑制其活性。最后我们发现KCTD1不影响AP-2α的DNA结合活性和蛋白质的稳定性,但抑制了AP-2调节的下游基因的mRNA表达。总之,KCTD1是一个核蛋白,抑制了AP-2家族的转录活性。
同样我们通过体内和体外的试验都证明了GAS41和AP-2β之间发生着相互作用,而且相互作用区域存在于AP-2β的C端和GAS41C端的激活结构域。其中GAS41的212位的赖氨酸,213位的天冬酰胺和214位的谷氨酸在与AP-2β的相互作用中起到了关键作用。最后,电泳迁移变动分析表明GAS41刺激了AP-2β的转录活性,至少部分通过增强了AP-2β的DNA结合活性,这些表明了GAS41的一个新的细胞功能即作为AP-2β的转录激活因子。
因此,我们证明了KCTD1和GAS41都与转录因子AP-2相互作用并调节其转录活性,但这两个蛋白以不同的方式影响着AP-2的转录活性,可能由于它们作用于AP-2蛋白的区域是不相同的。