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黄酮类药物与蛋白质的相互作用研究对于探索蛋白质生物学功能的微观机制和在分子水平上阐明药物的药理活性具有重要意义,同时可为新药靶点的发现和药物设计提供理论基础。本文利用荧光光谱、紫外吸收光谱、质谱和分子模拟等方法分别研究了人血清白蛋白(HAS)与4种黄酮醇(3,7-二羟基黄酮醇(3,7-diHF)、3,6-二羟基黄酮醇(3,6-diHF)、3,5,7-三羟基黄酮醇(Gal)和3,4,7,8-四羟基黄酮醇(tetra-HF)),3种异黄酮(4,5,7-三羟基异黄酮(Gen)、5,7-二羟基-4-甲氧基异黄酮(BioA)、3,4,7-三羟基异黄酮(3,4,7-triHF))和3种查尔酮类药物(2,4,4-三羟基查尔酮(2,4,4-triHC)、2,4-二羟基查尔酮(2,4-diHC)、4-羟基查尔酮(4-HC))相互作用的机制。 研究了pH值7.4.和3.5条件下黄酮类药物tetra-HF、3,7-diHF、3,6-diHF、Gal、Gen、Bio A、3,4,7-triHF、2,4,4-triHC、2,4-diHC和4-HC与不同构型的HAS相互作用的荧光光谱。根据Stern-Volmer方程和Scatchard方程研究了黄酮类药物与HAS结合的作用机制,包括荧光猝灭机理、结合常数和结合位点数,并探讨了相互结合的作用力类型。这些药物与HAS作用的荧光光谱的结果表明,在Cdrug/CHSA＜10的范围内,tetra-HF、3,7-diHF、3,6-diHF、Gal、Gen、:Bio A、3,4,7-triHF、2,4,4-triHC、2,4-diHC和4-HC在人血清白蛋白上主要有一个特征性的结合位点。药物结合引起的蛋白质色氨酸残基荧光猝灭机理主要是由静态引起的猝灭过程。从荧光淬灭光谱获得的结合常数可以看出,这些药物与蛋白质的结合常数在0.28～2.39×105 L·mol-1范围内,查尔酮类药物＞黄酮醇类药物＞异黄酮类药物,结合常数的差别以及荧光峰位的移动情况的不同说明药物的结合模式可能不同。在pH值7.4缓冲液中药物与蚩白质的结合能力比在pH3.5缓冲液中的强,这可能是因为在酸性条件下HAS结构发生了变化,HAS结构的改变对药物与蛋白结合的影响具有重要作用,药物分子在不同pH值下因为解离程度不同而与蛋白质结合的药物的结构也不同。 研究了黄酮类药物与HAS作用前后的紫外吸收光谱,结果表明黄酮类药物tetra-HF、3,7-diHF、3,6-diHF、Gal、Gen、Bio A、3,4,7-triHF、2,4,4-triHC、2,4-diHC和4-HC与HAS发生了相互作用。在pH值7.4条件下,与HAS结合后紫外光谱带Ⅰ的移动表明黄酮醇类药物和查尔酮类药物的B环和C环共轭系统参与了与HAS的结合,结合以后的药物主要以阴离子形式存在。峰位移动的情况反映了结合态药物与游离态药物的比例。异黄酮类药物的B环和C环不共轭,紫外光谱带Ⅰ呈肩峰,B环和C环共轭系统没有参与HAS的结合,而带Ⅱ的红移说明A环和C环的共轭系统参与了与HAS的结合。 研究了黄酮醇类药物(tetra-HF、3,7-diHF、3,6-diHF和Gal),异黄酮类药物(Gen、Bio A和3,4,7-triHIF)和查尔酮类药物(2,4,4-triHC、2,4-diHC和4-HC)在pH值7.4和3.5缓冲液中与人血清白蛋白作用前后的荧光光谱,与人血清白蛋白作用后,药物的荧光强度明显增加,这表明药物与人血清白蛋白发生了结合。随着蛋白质浓度的不断增加,药物的最大发射峰发生移动,这些结果说明药物在人血清白蛋白中的微环境与在水溶液中的不同。在pH值7.4的条件下,药物与人血清白蛋白的结合常数大小顺序:黄酮醇类药物＞查尔酮类药物＞异黄酮类药物,这是由于黄酮醇类药物本身具有荧光,它的3-OH的氢易与4-C=O的氧形成氢键,有利于形成有效的ESPT过程。由于异黄酮类药物的B环和C环没有形成共轭体系参与人血清白蛋白的结合,所以异黄酮类药物与人血清白蛋白的结合能力比较弱。在pH值3.5的条件下,也是黄酮醇类药物与人血清白蛋白的结合能力强。在pH值3.5的条件下,除了人血清白蛋白的结构会受到影响外,药物在不同pH值条件下解离程度也不一样。在pH值7.4条件下这些药物的结合常数都比在pH值3.5的条件下的结合常数大,这表明在pH值3.5缓冲液中人血清白蛋白的结构的链被打开,因此影响了药物与人血清白蛋白的结合,导致结合能力的降低。 利用荧光偏振的方法检测黄酮醇类药物tetra-HF、3,7-diHF和3,6-diHF在人血清白蛋白的存在下的荧光各向异性值的变化。低的人血清白蛋白浓度时呈现高的药物荧光各向异性值表明药物是以阴离子的形式与人血清白蛋白结合,且药物结合在人血清白蛋白的运动受限的位置上。随着人血清白蛋白浓度增加到1.0×10-5 mol·L-1时,tetra-HF、3,7-diHF和3,6-diHF体系的荧光各向异性值达到最大值,再继续增加人血清白蛋白的浓度,荧光各向异性值趋于平缓,这说明药物与人血清白蛋白的结合已经达到了饱和,3种黄酮醇类药物与人血清白蛋白作用是以1∶1的比例进行结合的,这与荧光猝灭光谱和荧光增强光谱的结果是一致的。 用时间分辨荧光光谱对3,7-diHF在pH值7.4缓冲液中与人血清白蛋白作用前后的荧光寿命进行了研究。药物与人血清白蛋白作用后,3,7-diHF的平均荧光寿命和荧光量子产率都明显增加,而它的非辐射速率常数降低,这表明3,7-diHF结合在人血清白蛋白的刚性的结合腔内。 采用质谱方法研究了tetra-HF与人血清白蛋白的相互作用。Q-TOF质谱分析结果表明HAS与tetra-HF作用后,HAS的分子量从66398 Da增加到66683 Da,这说明tetra-HF与HAS发生了结合,tetra-HF与HAS相互作用是以1∶1的比例发生结合。Q-TOF质谱分析结果与UV吸收光谱和荧光光谱实验结果一致。 许多药物在HAS上主要有两个结合位置,位于亚结构域ⅡA和ⅢA。在N-F转变过程中,结构域Ⅰ和结构域Ⅱ的二级结构基本没有改变,而结构域Ⅲ有部分开链。荧光猝灭结果显示在pH值为3.5条件下黄酮类药物对人血清白蛋白的荧光猝灭光谱与在pH7.4条件下具有相似的光谱特性,这表明黄酮类药物结合在人血清白蛋白的结构域Ⅱ位置而不是结构域Ⅲ,即siteⅠ位置,这是因为人血清白蛋白的结构域Ⅲ在pH值为3.5条件下已开链。 选择标记物PB、IB和Dig分别作为siteⅠ、siteⅡ和siteⅢ已知结合位置的标记物对黄酮醇类药物tetra-HF、3,7-diHF和3,6-diHF在蛋白质上的结合位置进行竞争替代实验。实验结果表明在3种黄酮醇类药物中,PB体系的荧光光谱强度和结合常数与未加入标记物的相比明显降低,而IB和Dig的加入对体系的原有荧光猝灭强度和结合常数变化不大,这说明PB替代了与人血清白蛋白结合的黄酮醇类药物tetra-HF、3,7-diHF和3,6-diHF,由此确定3种黄酮醇类药物tetra-HF、3,7-diHF和3,6-diHF结合在人血清白蛋白的siteⅠ位置,也即是结合位置位于亚结构域ⅡA。 通过分子模拟的方法对黄酮醇类药物tetra-HF、3,7-diHF和3,6-diHF在人血清白蛋白上的结合位置进行了研究。模拟结果表明tetra-HF、3,7-diHF和3,6-diHF都是结合在由氨基酸残基形成的疏水口袋内,位于人血清白蛋白的亚结构域ⅡA处,即siteⅠ位置。Tetra-HF、3,7-diHF和3,6-diHF与人血清白蛋白结合主要是通过疏水作用力、静电力和氢键作用力起稳定作用。Tetra-HF和3,7-diHF的苯环部分距离色氨酸残基Trp-214很近,能有效猝灭Trp-214的荧光,这与荧光光谱结果是一致的。