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目的本研究通过成功建立体外两大模型——血脑屏障模型(bEnd.3)及多巴胺能神经元模型(SH-SY5Y),采用不同生物学手段,首先探讨经典型蛋白激酶C(cPKC:PKCα/PKCβ)通过调控紧密连接蛋白(TJPs)的表达,引起百草枯(PQ)致小鼠脑微血管内皮细胞(bEnd.3)通透性异常的机制;其次探讨PQ染毒SH-SY5Y细胞后通过刺激细胞释放高迁移率族蛋白1(HMGB1),激活RAGE/NF-κB信号通路引起神经元炎症损伤的机制。方法(一)PKCα/β通过调控紧密连接蛋白参与百草枯致脑微血管内皮细胞的通透性异常1.评价体外血脑屏障模型的有效性。以Transwell小室作为共培养体系的载体,对培养1-7 d的永生化小鼠脑微血管内皮细胞株bEnd.3细胞进行形态学观察,采用细胞电阻仪测定其跨内皮细胞电阻(TEER)值,采用荧光分光光度法(Fluorescence Spectrophotometry,FS)测定荧光素钠(Na-FLU)通透性,以确保所建立的体外模型具有血脑屏障的功能。2.确定PQ染毒对脑微血管内皮细胞损害的剂量/时间-效应关系。分别用终浓度为0、50、100、200、300μmol/L PQ处理bEnd.3细胞24 h,以及200μmol/L PQ处理细胞0、6、12、24、48、72 h,四甲基偶氮唑蓝(MTT)检测细胞相对存活率,以确定PQ对脑微血管内皮细胞的损伤是否具备剂量-效应关系和时间-效应关系。3.探讨PQ染毒对脑微血管内皮细胞屏障功能的影响。用终浓度为0、50、100、200、300μmol/L PQ染毒bEnd.3细胞24h,分别检测细胞TEER值和通透性的变化,观察PQ是否引起体外血脑屏障模型功能的破坏。4.探讨PQ染毒对脑微血管内皮细胞紧密连接蛋白及基因表达水平的影响。终浓度为0、100、200、300μmol/L PQ处理bEnd.3细胞24 h,用免疫荧光法(Immunofluorescence,IF)和实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)分别测定紧密连接蛋白(ZO-1、Occludin、Claudin-5)和基因的表达水平。5.探讨PQ染毒对脑微血管内皮细胞骨架蛋白(F-actin)表达的影响。用终浓度为0、100、200、300μmol/L PQ处理bEnd.3细胞24 h,用免疫荧光法(IF)测定各组F-actin蛋白表达水平。6.探讨PQ染毒对P-糖蛋白(P-gp)表达水平的影响。用终浓度为0、100、200、300μmol/L PQ处理bEnd.3细胞24 h,用免疫细胞化学法(Immunocytochemistry,ICC)及免疫印迹(Western Blot,WB)检测p-gp蛋白表达水平变化。7.探讨PQ染毒对脑微血管内皮细胞PKCɑ/β蛋白表达水平的影响。终浓度0、100、200、300μmol/L PQ处理bEnd.3细胞24 h,免疫印迹法测定PKCα、PKCβ、p-PKCα、p-PKCβ蛋白表达水平变化。8.探讨经典PKC抑制剂(Go 6983)干预对脑微血管内皮细胞TJPs表达水平的影响。将细胞分为三组:对照组、200μmol/L PQ染毒组、干预组(Go 6983+200μmol/L PQ染毒组),经典PKC抑制剂(Go 6983)1μM预处理细胞1 h后,200μmol/L PQ染毒细胞24 h,Western blot测定ZO-1、Occludin、Claudin-5及p-PKCα、p-PKCβ蛋白表达水平。(二)HMGB1介导RAGE/NF-κB信号通路在百草枯致神经元炎症损伤中的机制1.观察人神经母细胞瘤细胞系亚型SH-SY5Y细胞形态学,及PQ对SH-SY5Y细胞增殖活性的影响。分别用终浓度为0、50、100、200、400、600、800μmol/L的PQ处理细胞48 h,以及终浓度为400μmol/L PQ分别处理细胞0、6、12、24、48、72、96 h,四甲基偶氮唑蓝(MTT)检测细胞相对存活率,以确定剂量-效应关系及时间-效应关系。2.探讨PQ对SH-SY5Y细胞释放、迁移HMGB1的影响。用终浓度为400μmol/L PQ处理SH-SY5Y细胞0、12、24、36、48 h,分别用免疫印迹法(WB)和酶联免疫吸附法(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)检测胞核、胞质及上清液中HMGB1蛋白表达水平;用免疫荧光法(IF)标记随PQ染毒时间延长HMGB1的迁移过程。3.观察HMGB1释放对RAGE/NF-κB信号通路的影响。终浓度0、75、150、300μmol/L PQ诱导24 h,以500μmol/L 1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP~+)作为阳性对照,用Western blot检测RAGE、RAS、P38/p-P38、IκB/p-IκB、P65蛋白表达水平。4.观察HMGB1释放对炎症因子的影响。终浓度0、75、150、300μmol/L PQ诱导24 h,以500μmol/L MPP~+作为阳性对照,用Western blot检测炎症因子TNF-α、IL-6蛋白表达水平。5.探讨NF-κB抑制剂PDTC处理对RAGE/NF-κB信号通路的影响。将细胞分为四组:对照组、400μmol/L PQ染毒组、PDTC+400μmol/L PQ染毒组、PDTC处理组,50μM PDTC预处理细胞1 h后,400μmol/L PQ染毒细胞24 h,Western blot测定IκB/p-IκB、P65及炎症因子TNF-α、IL-6蛋白表达水平。结果(一)bEnd.3细胞的跨内皮细胞电阻(TEER)随培养时间延长逐渐升高,于第6d达到峰值(114.3±6.9Ω·cm2),荧光素钠通透性检测显示,细胞通透性随培养时间延长逐渐降低,于第6 d降至1.7±0.2 cm/min,说明细胞屏障功能良好;MTT检测结果显示,与对照组比较,100、200、300μmol/L PQ染毒细胞24 h后,细胞存活率明显降低(P<0.05),200μmol/L PQ染毒细胞12、24、48、72 h,细胞存活率明显降低,差异有统计学意义(P<0.05),呈剂量依赖和时间依赖方式;IF和qRT-PCR显示,随着PQ浓度的升高,ZO-1、Occludin、Claudin-5蛋白和基因表达量显著减少(P<0.05);IF结果显示,对照组可见F-actin分布在细胞质周边,形成肌动蛋白丝带,线条完整连续,未见明显缝隙形成,而PQ染毒后,可见明显的荧光强度降低,线条断裂,尤其是高剂量组最为明显,差异具有统计学意义(P<0.05);ICC和Western Blot显示,P-gp的表达量在100μmol/L PQ染毒时出现明显代偿性升高随后下降,差异具有统计学意义(P<0.05);Western blot显示,与对照组比较,PQ染毒组的p-PKCα、p-PKCβ蛋白表达水平明显升高,ZO-1、Occludin、Claudin-5蛋白表达量明显降低(P<0.05);Go 6983干预组的ZO-1、Occludin、Claudin-5蛋白表达水平较染毒组明显升高,p-PKCα、p-PKCβ蛋白表达水平明显下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。(二)对SH-SY5Y细胞进行形态学观察发现,随着培养时间的延长,细胞数量增多,细胞间排列紧密;MTT检测结果显示,随PQ浓度的升高,染毒48 h各组细胞相对存活率均有明显降低,400μmol/L PQ染毒细胞0、12、24、48、72、96 h,细胞存活率明显降低,差异有统计学意义(P<0.05),呈剂量依赖和时间依赖方式;Western Blot和ELISA结果显示,胞核、胞质及上清液中HMGB1蛋白表达均先升高后降低,且分别在PQ染毒12、24、48 h处达到高峰;IF结果显示,对照组中HMGB1主要聚集在细胞核中,PQ染毒后HMGB1表达水平升高,且随时间延长,由细胞核迁移到细胞质,并进一步释放到细胞外;Western blot显示,与对照组相比,RAGE、RAS、P38/p-P38、IκB/p-IκB、P65以及炎性因子TNF-α、IL-6的相对表达量均随PQ浓度的升高而增多,差异具有统计学意义(P<0.05);加入抑制剂PDTC预处理后,与400μmol/L PQ染毒组相比,PDTC预处理1h后IκB/p-IκB、P65及炎症因子TNF-α、IL-6蛋白表达水平明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05)结论百草枯可以直接诱导脑微血管内皮细胞损伤,同时通过激活cPKC(PKCα、PKCβ)导致紧密连接蛋白/基因表达降低,引起小鼠脑微血管内皮细胞通透性升高,这两方面因素共同导致血脑屏障的通透性异常;经由血脑屏障进入中枢神经系统的PQ,通过刺激多巴胺能神经元释放HMGB1,与细胞膜受体RAGE结合,激活NF-κB信号通路,使得炎性因子释放失控,导致神经元的炎症损伤,这可能是百草枯致帕金森病的机制之一。