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肽聚糖识别蛋白(PGRPs)是一类可识别肽聚糖和含肽聚糖的细菌的模式识别受体,在天然免疫应答中发挥着重要的识别和调节功能。本论文以小菜蛾为实验材料,对PGRP基因的克隆、组织表达差异性和在细胞中的表达进行了详尽的研究。
首先,克隆了PxPGRP全长cDNA编码序列。利用GenBank中已报道的几种昆虫PGRP基因的氨基酸序列,设计简并引物。以小菜蛾总RNA为模板,利用RT-PCR结合RACE技术,克隆了PxPGRP基因全长的cDNA编码序列(命名为:PxPGRP),GenBank登录号为EU399240,利用ORFfinder在线生物学软件对PxPGRP序列进行分析表明,PxPGRP基因开放阅读框(ORF)为588 bp,编码195个氨基酸残基;预测其分子量为21.0 kDa,等电点为8.38;成熟肽的分子量为19.0kDa,等电点为8.86。
其次,利用半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR对PGRP的时空表达差异性进行了检测,利用半定量RT-PCR对PxPGRP在小菜蛾不同发育阶段的时空转录水平检测表明:PxPGRP在小菜蛾不同发育阶段都有表达,比较而言,PxPGRP在4龄幼虫中的转录水平较高;利用实时荧光定量PCR对PxPGRP在小菜蛾4龄幼虫的血细胞、表皮、脂肪体、中肠、马氏管等组织中的表达水平进行检测,表明PxPGRP基因在不同组织中的转录水平存在显著差异,PxPGRP基因转录水平依次为表皮、马氏管、脂肪体、血细胞和中肠。
最后,为研究PxPGRP的结构和功能的关系,在昆虫细胞中表达了PxPGRP基因。利用RT-PCR扩增了PxPGRP基因的ORF序列并链接到转染载体pEGFP—C3上,构建了表达质粒pEGFP—C3-PGRP,将表达质粒pEGFP—C3-PGRP分别转染到SL-1和Sf9细胞中,在转染试剂的诱导下进行了表达。利用荧光倒置显微镜观察,表明PxPGRP基因在这两种细胞中都得到了高效融合表达,且Sf9细胞的表达量比SL-1细胞高;SDS-PAGE检测表明PxPGRP在昆虫细胞中可表达相对分子质量(Mr)为66.0kDa的融合蛋白,与预测的融合蛋白的分子大小相当。
本研究对PxPGRP基因的全长cDNA序列进行了克隆,对其时空和组织表达差异性进行了分析,不仅补充了昆虫PGRP家族成员,也为小菜蛾的生物防治提供了新的靶标;PxPGRP在两种昆虫细胞中的高效表达为其结构和功能的研究奠定了基础。