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根结线虫(Meloidogyne)是一种固着性的专性寄生线虫,是为害最严重的植物病原物之一,现有的防治方法对防治根结线虫效果较差。运用RNA干涉原理培育抗根结线虫植物成为防治根结线虫病的新途径。本文在崔汝强博士(2006)通过抑制差减杂交建立的EST文库基础上进行研究。希望找到对根结线虫发育或侵染有重要影响的基因,为下一步培育抗线虫植物提供基础。本论文主要研究成果如下:
1、克隆了爪哇根结线虫(M.javanica)基因MjD15和MjF的cDNA全长序列和基因组编码区。其中MjD15基因组编码区含有2个内含子和3个外显子;MjF基因组编码区含有2个内含子和3个外显子。MjD15和MjF基因均是目前还未发现同源蛋白的新基因。
2、应用半定量RT-PCR方法对基因MjD15,Mj—Mrlc和MjF基因在爪哇根结线虫的各个发育阶段表达进行分析。结果表明,MjD15基因在爪哇根结线虫的双胞—多胞期、囊胚期、原肠期—原肠晚期、一龄幼虫、二龄幼虫均有表达,在成熟雌虫中没有表达;Mj—Mrlc和MjF基因在爪哇根结线虫的个体发育阶段均有表达。
3、应用原位杂交方法对Mj—Mrlc在爪哇根结线虫虫体内进行组织定位,结果显示Mj—Mrlc在根结线虫食道腺中表达。
4、利用dsRNA浸泡方法对爪哇根结线虫二龄幼虫的基因MjD15、Mj—Mrlc和MjF进行沉默试验。结果显示,在基因MjD15和Mj—Mrlc沉默后,线虫活动、死亡率、运动形态均没有改变,但二龄幼虫侵染率明显降低;MjF沉默后线虫呈僵直状态。
5、在已克隆的基因Mj—Mrlc和MjD15的基础上,构建了原核表达载体Pet—28a—Mrlc和Pet—28a—MjD15,经IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳分析显示,Mrlc表达的蛋白分子量约为17kD,MjD15表达的蛋白分子量为32.5kD。为进一步确定该蛋白的作用和生化特性打下基础。
本论文通过研究基因的时空表达分布、沉默后表型变化和侵染能力的变化,获得2个新的与根结线虫侵染相关的基因Mj—Mrlc和MjD15,为进一步研究根结线虫与植物相互作用机理打下基础。