论文部分内容阅读
铝毒是酸性土壤限制植物和微生物生长的主要因子。酸性土壤中存在一些微生物，能够在高浓度铝条件下生长。本实验室前期在江西红壤中分离到一株高耐铝红酵母RS1(Rhodotorula taiwanensis RS1)，并对其耐铝机制进行了初步研究，但是确切耐铝机制尚不清楚。本文在前期研究基础上:(1)选取铝敏感红酵母Rm(R.mucilaginosa AKU4812)作为对照，比较了RS1和Rm耐铝性差异，分析了二者铝含量和分布、有机酸含量和细胞表面电荷的差异;(2)通过随机诱变技术，得到了铝敏感突变体alsm1(Al sensitive mutant1，alsm1)，对RS1和alsm1进行转录组测序，研究在铝胁迫下RS1和alsm1转录组学特征差异;(3)将RS1cDNA文库导入酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中，从中挑选出耐铝性增强的菌株，初步筛选出一些耐铝基因;(4)研究了镁、锰、磷和细胞壁多糖在RS1耐铝中的作用。主要研究结果如下: 1，相对于RS1，Rm对铝极为敏感，1mmol/L铝就能完全抑制Rm生长，而200mmol/L铝才能完全抑制RS1生长。Rm细胞铝含量随处理铝浓度升高而迅速升高，同时在相同浓度铝处理下，Rm铝含量远高于RS1;在低浓度铝下，RS1细胞铝含量非常低，直到高浓度铝下RS1细胞铝含量才达到低浓度铝下Rm铝含量水平。在相同浓度铝处理下，RS1胞内铝含量也比Rm低;同时RS1细胞壁厚度在对照和铝处理下都显著大于Rm，RS1较Rm细胞具有更高的zeta电位和更低的阿辛蓝吸附能力，这导致了RS1细胞壁对铝的吸附能力较Rm细胞壁弱，这是导致二者耐铝性差异的主要原因。 2，对RS1进行随机诱变，得到铝敏感突变体alsm1，铝处理后alsm1较RS1受铝抑制更强且具有更高的细胞铝含量，但二者细胞壁厚度、细胞表面zeta电位无明显差异，有机酸含量也不能解释RS1和alsm1耐铝差异。 3，对RS1转录组数据进行GO(Gene Ontology)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)分析，铝处理后差异表达基因主要被富集在核糖体、核糖体合成、核糖蛋白复合体、氧化磷酸化和细胞组分生物合成等分类中，这说明在铝处理后细胞需要大量的核糖体和蛋白合成去满足对新合成有机物质的需求，线粒体也在耐铝中起到重要作用。与RS1不同，alsm1铝处理后差异表达基因主要富集在细胞周期、脂肪酸代谢和氨基酸代谢等相关KEGG通路中，这说明铝处理后RS1、alsm1也具有不同的转录组响应模式，这种不同转录组响应机制可能是RS1、alsm1耐铝性不同的主要原因。同时RS1、alsm1还有大量未显著富集基因，包括细胞壁、有机酸代谢、抗氧化等基因也受铝胁迫影响，其中部分基因表达在RS1、alsm1中差异较大。同时对照条件下alsm1与RS1相比较，alsm1中下调基因显著富集在同源重组、类固醇生物合成和酵母细胞周期通路中，这说明对照下alsm1基因表达也与RS1有所不同。 4，RS1铝处理后提取mRNA建立cDNA文库，并转化到酿酒酵母中，从中筛选出11个能够在加铝平板上生长的转化子，通过质粒测序和blast，得到若干增强酿酒酵母耐铝性的基因，包括有机酸代谢相关、线粒体转运蛋白、翻译延伸因子、聚泛素、核糖体和C4甲基固醇氧化酶等基因。 5，采用不同浓度镁与铝同时处理，发现镁能显著缓解Rm铝毒，但对RS1无明显影响;RS1细胞壁磷含量显著低于Rm，这可能导致了RS1细胞壁较低的铝吸附量;采用多种抑制剂对RS1处理，发现衣霉素降低了RS1的耐铝能力，说明天冬酰胺(N)-连接的糖蛋白修饰受抑制后，RS1耐铝性显著下降。