论文部分内容阅读
卵巢上皮癌(Epithelial Ovarian Cancer,EOC;以下简称卵巢癌)位于妇科肿瘤性死亡原因的首位。虽然随着科学技术发展和外科技巧的提高,目前大多数卵巢癌都能得到手术切除,但其总体生存率仍然不尽人意。其主要原因是卵巢癌具有极强的侵袭能力。一旦发现远处转移,其生存率将急剧下降。所以,针对卵巢癌侵袭转移机制的研究一直是科学热点。上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)是指上皮细胞转变为具有间质表型细胞特点的生物学过程,目前广泛认为EMT是肿瘤侵袭转移的重要方式。趋化因子CXCL12,又称为基质衍生因子1(stromal cell-derived factor-1,SDF-1),属于趋化因子CXC家族,可以与其受体结合促进肿瘤细胞的生长、增殖及侵袭或者直接募集内皮祖细胞促进肿瘤血管生成。已有学者发现,CXCL12在卵巢癌的发生、发展及转移的过程亦发挥着重要作用。失巢凋亡(Anoikis)是一种特殊形式的细胞程序性死亡(Programmed cell death,PCD),主要是由于细胞与细胞外基质(Extracellular matrixc,ECM)或者细胞与其邻近细胞相互脱离而诱发。多项研究表明,失巢凋亡在许多组织的上皮细胞恶性转变过程中发挥着重要作用。失巢凋亡抵抗可以延长肿瘤细胞从原发病灶脱离后的生存时间,从而为肿瘤的远处转移提供了先决条件。基于上述研究背景,我们推测,趋化因子CXCL12能否通过诱导卵巢癌细胞发生EMT的方式促进肿瘤细胞的侵袭转移,并同时增强卵巢癌细胞失巢凋亡抵抗的能力促进其在体外存活。为了验证此假说,本课题主要从以下几个方面开展研究:1、采用Western blot检测三种卵巢癌细胞系(SKOV3、HO-8910、A2780)中CXCL12受体CXCR4及CXCR7蛋白的表达情况;2、采用MTT、Transwell及Wound-healing等实验检测CXCL12处理前后的卵巢癌细胞体外增殖、侵袭、迁移能力的改变;3、采用光学显微镜镜下观察CXCL12与卵巢癌细胞共培养后,细胞形态学的变化;4、流式细胞术检测失巢培养状态下CXCL12作用前后卵巢癌细胞凋亡率的变化;5、采用Western blot检测EMT及凋亡相关蛋白的表达变化,CXCL12可能主要通过与CXCR7结合发挥作用;6、采集临床卵巢癌组织标本,采用免疫组织化学方法检测CXCR7在不同卵巢组织(正常卵巢组织、良性卵巢肿瘤及恶性卵巢肿瘤)中的表达水平;7、收集相关卵巢癌患者的临床病理学资料,并随访,进行数据分析及统计学处理,获得CXCR7在卵巢癌患者中的临床意义。本课题主要分为三个部分:第一部分CXCL12能够促进卵巢癌细胞体外增殖、侵袭迁移等生物学特性目的获取CXCL12促进卵巢癌细胞增殖、侵袭及迁移的实验证据方法Western blot检测三种卵巢癌细胞系(SKOV3、HO-8910、A2780)中CXCL12受体CXCR4及CXCR7蛋白的表达情况。通过MTT实验方法检测CXCL12与不同卵巢癌细胞系(SKOV3、HO-8910、A2780)共培养24h后,卵巢癌细胞体外增殖指数的变化,然后通过Transwell及划痕实验检测CXCL12对卵巢癌细胞的侵袭转移能力的变化。结果Western blot检测三种卵巢癌细胞系(SKOV3、HO-8910、A2780)中均有CXCR4及CXCR7蛋白的表达。MTT检测24h细胞增殖,发现CXCL12能够促进其增殖,并且具有浓度依赖性;Transwell实验证明,CXCL12能够显著促进卵巢癌细胞的侵袭能力,与MTT结果一样,亦存在浓度依赖性;划痕实验进一步验证了CXCL12能够促进卵巢癌细胞的迁移能力。结论CXCL12可以促进卵巢癌细胞增殖、侵袭及迁移的能力。第二部分CXCL12促进卵巢癌细胞生物学特性改变的相关机制研究目的探讨CXCL12促进卵巢癌细胞发生生物学改变的相关机制方法首先我们采用光学显微镜镜下观察CXCL12与卵巢癌细胞(SKOV3、HO8910和A2780)共培养48h后细胞形态的变化;然后失巢培养状态下观察CXCL12与卵巢癌细胞作用48h后,细胞存活情况以及卵巢癌细胞成球数量的变化;接下来采用Western blot检测EMT及失巢凋亡相关蛋白的表达变化;最后应用流式细胞术检测CXCL12对卵巢癌细胞凋率亡的影响。结果光学显微镜镜下观察,常规培养基中加入100 ng/m L CXCL12作用48h能够诱导SKOV3和HO-8910细胞发生EMT样改变,而A2780变化不明显;失巢培养状态下加入100 ng/m L CXCL12作用48h发现卵巢癌细胞凋亡数目减少,成球数量显著增多;Western blot结果显示,细胞表面受体CXCR7和CXCR4表达上调,其中CXCR7上调表达更显著,E-cadherin下调,Vimentin和β-catenin表达上调,促进凋亡发生的指标caspase3和Bax下调,抑制凋亡发生的指标B细胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)表达上调;流式细胞术结果显示,失巢培养过程中加入100 ng/m L CXCL12 48h后,第二象限(早期凋亡数)+第四象限(晚期凋亡数)之和显著减少。结论CXCL12通过激活卵巢癌细胞表面的CXCR7(可能发挥主要作用)和/或CXCR4,诱导卵巢癌细胞发生EMT样改变和抑制卵巢细胞发生失巢凋亡的方式来促进肿瘤细胞的生存及转移。第三部分CXCL12受体CXCR7在卵巢癌患者中的临床意义及预后的相关性分析目的研究卵巢癌组织中CXCR7表达水平与临床病理学指标及预后的相关性。方法采用免疫组化法检测CXCR7在不同卵巢组织(正常卵巢组织、良性卵巢肿瘤及恶性卵巢肿瘤)中的表达水平,然后将其与患者的临床病理学资料进行相关性分析;采用单因素及多因素分析卵巢恶性肿瘤不良预后的指标,并通过采用Kaplan-Meier法和Log-Rank检验对比两组患者的总生存率及无瘤生存期。结果CXCR7阳性表达于细胞膜和细胞质中,在恶性卵巢肿瘤组织中CXCR7的阳性表达率为68.42%(39/57),良性卵巢肿瘤组织中CXCR7的阳性表达率为26.7%(4/15),正常卵巢组织中CXCR7的阳性表达率为13.3%(2/15),与其它两组相比,CXCR7在恶性卵巢肿瘤组织中的表达存在显著性统计学意义。进一步与患者的临床病理学资料相关性分析得出,趋化因子受体CXCR7的阳性表达与患者的年龄、术前CA125水平、卵巢癌肿瘤病理类型、残余肿瘤直径、腹水的含量及肿瘤的大小无明显关联,差异无明显统计学意义(P>0.05);而与患者FIGO分期、肿瘤的组织学分级、有无淋巴结转移及腹腔转移存在关联,差异存在明显统计学意义(P<0.05)。单因素及多因素分析发现CXCR7阳性表达水平、患者FIGO分期、肿瘤的组织学分级、有无淋巴结转移及腹腔转移与卵巢恶性肿瘤患者的总生存率和无瘤生存率存在统计学意义上的关联,且为卵巢癌患者预后的不良因素。与CXCR7阴性患者相比,CXCR7阳性患者的总生存率(P=0.025)和无瘤生存率(P=0.043)均显著减少。结论卵巢癌组织中CXCR7表达显著增高,并且高表达CXCR7的卵巢癌患者预后不良,提示我们CXCR7有可能作为预测卵巢癌患者临床预后的一个新靶标。全文结论CXCL12能够在体外促进卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的增加,并且能够显著提高卵巢癌细胞失巢凋亡抵抗能力,这些作用可能主要通过与其受体CXCR7相结合后诱导细胞发生EMT样改变及抑制细胞失巢凋亡的方式来实现。临床试验进一步证明,CXCR7在卵巢癌组织中高表达,且CXCR7表达水平与卵巢癌临床病理指标及患者的总体生存率和无瘤生存率存在明显的相关性。