【摘 要】
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本文以山杨（Populus davidiana Dodetumefaciens）为受体材料,采用根癌农杆菌介导的叶盘转化法进行外源双价抗虫基因（Bt+蜘蛛杀虫肽）的遗传转化研究,探讨了影响山杨遗传转化的若干
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本文以山杨（Populus davidiana Dodetumefaciens）为受体材料,采用根癌农杆菌介导的叶盘转化法进行外源双价抗虫基因（Bt+蜘蛛杀虫肽）的遗传转化研究,探讨了影响山杨遗传转化的若干因子,初步建立了山杨遗传转化体系;获得了转化再生的植株,经PCR检测和Southern杂交检测,证明了目的基因已经整合到山杨的基因组中,为山杨的遗传转化及抗虫育种提供了理论基础和研究材料。本试验的研究结果如下:1、优化了山杨组培再生体系,结果表明,山杨不同组织的适宜培养基分别为:分化培养基:MS+BA 0.5 mg/L+NAA 0.01 mg/L;生根培养基:WPM+IBA 0.4 mg/L。2、筛选了山杨转化体及选择生根培养的卡那霉素和头孢噻肟钠浓度。卡那霉素抑制叶片分化的浓度下限为20 mg/L,芽诱导生根的卡那霉素临界浓度为20 mg/L;700mg/L的头孢噻肟钠能有效的除菌,且对叶片分化及生根培养没有不利影响。3、探讨了影响山杨遗传转化的主要因子,初步确立了山杨遗传转化体系。将带切口的健壮叶片预培养2 d后,用无菌蒸馏水稀释成OD600=0.3～0.4、培养至对数生长期的农杆菌(OD600=0.5)侵染叶片10～15min;共培养2 d后,转入到筛选培养基（附加700mg/L头孢噻肟钠+20 mg/L卡那霉素的MS培养基）中进行诱导抗性不定芽生长,当抗性不定芽长到1.5～2 cm时转入选择生根培养基（附加800 mg/L头孢噻肟钠+20 mg/L卡那霉素的WPM培养基）中诱导其生根。4、试验共侵染山杨叶片1862个,经过多次筛选和选择获得56个抗性芽,抗性芽率为3.0%。由抗性芽在经过选择生根培养后得到13株抗性植株,抗性芽生根率为23.2%5、对13个抗性植株的叶片进行PCR检测,其中有3株呈阳性,阳性率为23.1%。将呈阳性的叶片进行Southern杂交检测,3株均呈阳性,阳性率为100%,转化率为1.6‰。
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