论文部分内容阅读
本文通过超速离心的方法从溶藻弧菌中提取外膜蛋白(Outer membraneproteins，Omp)，经SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝G-250染色后，显示四条清晰的蛋白条带，其分子量分别为35.6kD、39.3kD、43．1kD、47.8kD。
用Western Blot印迹检测溶藻弧菌Omp与兔抗溶藻弧菌血清免疫反应，兔抗溶藻弧菌血清与溶藻弧菌Omp有一条主要的免疫反应带，其分子量为35.6kD，同时还有两条微弱的显色带，其分子量分别为39.3kD和47.8kD。结果表明，35.6kD Omp具有较强的免疫原性，能刺激机体产生很强的免疫应答，因而，初步认为35.6kD外膜蛋白是溶藻弧茵的主要外膜蛋白(Major Outer membrane protein，MOmp)。
溶藻弧菌的MOmp通过切胶回收，离心后冷冻干燥获得了35.6kD Omp的纯品，并用透析法制备了免疫刺激复合物亚单位疫苗(ISCOM-MOmp)，对红鳍笛鲷(Lutjnussanguineus)进行免疫接种，用免疫扩散法测得在第5周时的血清效价为1：16，持续一段时间后再缓慢下降。第10周用9.3×10<8>cfu／mL溶藻弧菌活菌腹腔攻毒，其免疫保护率为71.4％，对照组的存活率仅为6.7％。因而认为所得的35.6kD的外膜蛋白为溶藻弧菌的主要保护性抗原。切胶回收的Omp用Western Blot印迹检测仍有清晰的反应条带，说明回收后它仍存在抗原活性。
35.6kD MOmp经过SDS-PAGE后转移到PVDF膜上，用PROCISE cLC蛋白测序系统进行N末端氨基酸序列分析，测得27个氨基酸，结果为ATVYK DGGTE LLVGGRVEFRGDFIG SD。
利用限制性内切酶Sau3A I将溶藻弧菌染色体DNA进行完全酶切后，与经过BamHI酶切、脱磷酸后的pUCl8连接重组，感染受体菌E.coli DH5α，构建溶藻弧菌的部分基冈文库。获得了500个白斑菌落。
根据所得MOmp N端氨基酸序列，设计了两条寡核苷酸探针，探针I为5’-----GCAACA(C)GTTTAT(C)AAAGAT(C)GGT(C)GGC(T)ACTGAGCTACTAGTTGGC(T)GGT(G)CGCGTT-----3’；探针Ⅱ为5’----CTACTAGTTGGC(T)GGT(G)CGCGTTGAGTTT(C)CGT GGC(T)GAC(T)TTCATC(T)GGTTCAGAT(C)-----3’。地高辛标记后与500个白斑菌落原位杂交筛选重组菌落。第2条探针与溶藻弧菌基因文库杂交没有出现阳性克隆菌落。挑取第1探针与文库杂交反应呈阳性的10株重组菌，碱裂解提取质粒后进行斑点杂交，获得两株阳性克隆菌株。对其中一个重组质粒进行DNA测序，获得一段1.9Kb的DNA片段，ORF分析后发现其中有一段阅读框编码精氨酸脱亚胺酶(Arginine deiminase)，该系统相关的蛋白与外膜的通透性有关，可能是外膜蛋白中的孔蛋白。