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本研究根据GenBank中注册的猪CCK基因序列设计引物,采用RT-PCR技术成功扩增到猪CCK基因C-端活性片段,将其cDNA克隆至T载体,获得猪CCK基因片段的核苷酸序列;根据pRSETA载体序列,设计一对引物,采用PCR技术从重组质粒oRSETA-4CCK33上扩增到鸡CCK33四串体基因片段。结果表明,猪CCK基因片段长度为210bp,编码70个氨基酸;鸡CCK33四串体基因片段长度为495bp,编码165个氨基酸。分别将猪CCK基因片段和鸡CCK33基因四串体片段克隆至大肠杆菌表达载体pBX,并获得成功表达,所表达的融合蛋白mysB-CCK、mysB-4CCK33主要以可溶形式存在于细菌裂解上清中,其相对分子量分别为4.5×10<4>和5.3×10<4>,用vL凝胶成像系统BioID++程序对电泳图谱进行扫描分析表明,达到各自的最大表达量时,两种融合蛋白分别占菌体蛋白总量的40.21%、30.08%。Western blotting结果表明,表达产物都能与CCK-8阳性血清发生特异性反应,说明融合蛋白上的CCK-8片段为主要抗原决定簇。用50%Ni-NTA对所表达的两种融合蛋白通过亲和层析的方法进行纯化,结果表明,两种融合蛋白纯化成功,纯化后的蛋白浓度为别为8.86mg/mL和4.12mg/mL。
将纯化的融合蛋白mysB-CCK、mysB-4CCK33制成油乳剂疫苗,主动免疫蛋鸡。ELISA结果表明,两种融合蛋白都能在鸡体内引起免疫反应,第2次和第3次加强免疫后蛋鸡血清和蛋黄中的CCK抗体可维持较高水平,且两种融合蛋白刺激机体产生免疫反应的效果基本相同;第3次免疫后1周开始收集鸡蛋,分离蛋黄与蛋清,蛋黄采用冷冻真空干燥法制成蛋黄粉。
分别将制备的CCK油乳剂疫苗和含CCK抗体的蛋黄粉主动和被动免疫82天龄肉猪。饲养试验结果表明,主动免疫0.5mg/mL CCK疫苗处理组肉猪,试验期间平均日增重和采食量与空白对照组相比,差异显著(p<0.05),分别提高5.82%和4.04%;而主动免疫1.5mg/mL CCK疫苗组与空白对照组相比,差异不显著(p>0.05);在肉猪饲料中添加100g/t含CCK抗体的蛋黄粉,试验期间平均日增重和采食量与阴性蛋黄粉组相比,日增重和采食量分别提高6.64和8%,差异显著(p<0.05)。
将制备的含CCK抗体的蛋黄粉作为饲料添加剂饲喂20日龄肉鸡。试验结果表明,饲料中添加100g/t和300g/t含CCK抗体的蛋黄粉的处理组肉鸡,与阴性对照组相比,可在一定程度上提高肉鸡的采食量和体增重,但差异不显著(p>0.05);添加100g/t、300g/t含CCK抗体粉的处理组肉鸡与阴性对照组相比,试验全期体增重和采食量分别提高2.34%、0.91%和3.8%、2.65%,且不影响肉鸡的饲料转化率。