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害虫防治在农林生产中具有重要意义，鳞翅目昆虫作为农林害虫的主要类群备受关注。家蚕作为鳞翅目昆虫的重要代表，在昆虫研究中占有十分重要的地位。家蚕遗传资源丰富、形态多样、背景清晰，在昆虫遗传发育研究中具有明显优势。在众多家蚕遗传突变资源中，apodal(ap)突变具有胸足发育缺失和雌生殖系统异常等多重突变性状，是研究昆虫附肢发育和生殖系统形成的宝贵材料。同时，对胸足和雌生殖系统发育的研究能为害虫生物防治提供重要的理论依据。本小组前期研究将家蚕ap突变定位在3号染色体nscaf2930和nscaf2924之间，并对可能的候选基因Bmsob及其下游基因进行了初步研究；已知sob属于odd基因家族成员，odd家族基因在昆虫足及外生殖器发育中具有重要调控作用。然而，在家蚕中 odd家族基因未被鉴定，且相关功能研究还知之甚少。本研究通过生物信息学、序列克隆、表达模式分析等手段对家蚕 odd家族基因进行鉴定分析，并以家蚕野生型大造和ap突变为材料，利用qRT-PCR、原位杂交等手段对ap突变候选基因及可能的下游靶基因进行筛选分析，进而利用RNAi和转基因敲除等技术对候选基因的功能进行验证，以期对家蚕ap突变形成机制进行解析，为害虫生物防治提供新的靶标。 本研究主要内容包括：⑴家蚕odd家族基因在基因组上的分布：利用最新家蚕基因组拼接数据，我们对家蚕3号染色体nscaf2930和nscaf2924之间的gap区域进行补充，并发现odd家族4个基因在家蚕基因组3号染色体上依次串联分布，且Bmsob与Bmdrm、Bmodd之间相距较近，分别为107.5kb和107.7kb，Bmbowl与家族其它基因相距较远。同时，通过对包括家蚕在内的6个昆虫物种的 odd家族基因在基因组上的共线性分析发现，odd家族基因在昆虫基因组上的相对位置高度保守，按照drm、sob、odd及bowl依次串联分布，且该家族基因的方向也表现出高度保守性，在所选取的6个昆虫物种中，仅果蝇bowl基因序列方向与其它所选取昆虫不一致。这暗示该家族基因在昆虫中的进化历程可能来自同样的祖先序列。⑵通过odd家族基因鉴定和ap定位区间分析，我们发现，在ap分子定位区间内除候选基因Bmsob外，还存在同一家族的另一个基因Bmodd。通过对家蚕胚胎的连续解剖观察发现，胚胎2.5天至4.5天是家蚕胸足发生期，且胚胎2.5天至3.5天是胸足发育的关键时期。同时，对雌生殖系统连续解剖观察发现，蛹1天至蛹3天是家蚕雌生殖系统变态发育的关键阶段，也是交配囊形成的重要时期。⑶对Bmsob基因分别调控胸足和交配囊发育的潜在下游基因的表达情况进行调查，结果发现：BmAntp、BmUbx基因在 ap胚胎胸足发生期的表达量显著低于野生型，且 BmAntp基因与 Bmsob的表达趋势相关，可能参与家蚕胸足发育；在交配囊形成期Bmabd-A基因在ap突变雌生殖系统中的表达量显著高于野生型，且蛹1天至蛹3天表达趋势刚好与Bmsob相反。因此我们推测Bmabd-A可能作为Bmsob基因的下游基因参与交配囊形成的调控。⑷利用RNAi技术在胚胎期对Bmsob基因进行双链干涉，结果发现干涉后 Bmsob基因显著下调，但并未观察到胸足缺失表型。为了进一步探究Bmsob基因的功能，我们设计了Bmsob基因敲除的gRNA位点，构建敲除载体，在家蚕 BmN-SWU1细胞中验证位点活性，结果显示sob-gRNA-1位点具有较好的敲除活性；进而构建转基因敲除载体重组质粒piggBac(A3-dsRed)-BmU6-sob-gRNA-1。在野生型大造蚕卵中注射，并在 G1代得到了sob-gRNA-1位点阳性个体，通过与Cas9转基因系杂交，筛选获得阳性杂交个体，并在F2代幼虫中观察到部分胸足缺失，分子检测表明这些个体为Bmsob基因敲除嵌合体，且Bmsob基因mRNA水平显著下调。