微管结合蛋白EB1调控番茄果实货架期的机制研究

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背景和目的:番茄果实货架期短是番茄产业中的突出问题,每年造成巨大的资源浪费和经济损失。挖掘影响番茄果实货架期的新基因、解析果实成熟软化的分子机制和遗传改良果实货架期的研究一直都是国内外植物学研究的热点。目前的研究大多从抑制细胞壁降解的角度来延缓果实的软化,很少有从加强果实细胞壁合成的角度来延长果实货架期的报道。植物微管(Microtubules)是一种高度动态性的细胞骨架,参与调控细胞壁的合成,而微管骨架的动态性主要由微管结合蛋白来调控。本论文主要探究微管结合蛋白EB1对番茄果实发育和货架期的影响,以及可能的调控机制。  方法:定量RT-PCR分析番茄SlEB1基因在果实发育过程中的表达谱,构建SlEB1过表达和RNAi转基因番茄植株,检测野生型和转基因番茄植株对微管解聚药物戊炔草胺的敏感性,以及分析转基因果实的表型和货架期(包括果实的大小、重量、硬度、失水率、细胞壁厚度和角质层厚度等)。  结果:通过同源序列比对发现番茄的基因组中有两个EB1基因,分别命名为SlEB1a和SlEB1b。定量RT-PCR分析表明SlEB1a随番茄果实发育过程而变化,而SlEB1b也在果实中表达,但是表达不随发育过程而改变。我们克隆了SlEB1a和b基因,分别构建了GFP-SlEB1a过表达载体和同时沉默SlEB1a和b基因的RNAi载体(SlEB1Ri),转化番茄得获得2株GFP-SlEB1a高表达的过表达植株和3株SlEB1Ri植株(2个基因的表达量均低于野生型植株中基因表达量的10%)。与野生型植株相比,GFP-SlEB1a过表达植株对戊炔草胺更敏感,SlEB1Ri植株对戊炔草胺更耐受,表明SlEB1基因是微管稳定性的负调控因子。此外,果实的表型分析表明:与野生型植株相比,GFP-SlEB1a过表达植株的果实更易于软化,失水更快,且体积更小,而SlEB1Ri植株的果实更硬,失水更慢,且体积更大。果实石蜡切片显示,与野生型果实相比,GFP-SlEB1a过表达植株的果实角质层和细胞壁更薄,SlEB1Ri植株的果实角质层和细胞壁更厚。因此,沉默SlEB1a/b基因可以显著延长果实的货架期。  结论:GFP-SlEB1a过表达植株的微管稳定性下降,而SlEB1Ri植株的微管稳定性提高,说明番茄SlEB1基因是微管稳定性的负调控因子。此外,本研究结果表明GFP-SlEB1a过表达植株的果实体积变小、货架期变短,而SlEB1Ri植株的果实变大、货架期延长。进一步的石蜡切片分析表明,SlEB1基因可能是通过调节细胞壁的合成来影响番茄果实货架期的。该研究不仅鉴定了一个影响番茄果实货架期的新的调控因子,初步解析了微管结合蛋白可以通过调节细胞壁的合成来影响货架期的分子机制,而且为提高番茄货架期的遗传改良提供了新的思路。
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